黄花石蒜凝集素的纯化及性质研究

论文摘要

黄花石蒜球茎经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱（DEAE-Sepharose）和Sephacryl S-200分子筛层析得到经SDS-PAGE检测为单一蛋白带的黄花石蒜凝集素（Lycoris chinensis agglutinin,LCA）纯品。经SephacrylS-200凝胶过滤和SDS-PAGE测得其表观分子量为48KD,亚基分子量为12KD,表明LCA是由四个相同亚基组成的蛋白。LCA只凝集兔血细胞,其凝集兔血细胞效价为0.95ug/ml,但是对鸡血及人A、B、AB、O型血均不凝集。其凝血活性部分依赖于金属离子Ca2+、Mg2+。糖抑制实验结果表明,甘露聚糖是LCA的专一性抑制糖,其次是甘露糖。 295nm激发时,天然LCA的最大荧光发射峰在337.2nm处,比游离Trp的最大荧光发射峰348nm蓝移了10.8nm,说明Trp周围的极性较弱,并未完全暴露于周围溶剂中。280nm激发时,其最大荧光发射峰也在337.2nm处,荧光强度增加,说明LCA的内源荧光发生了从Tyr到Trp的能量转移。 研究了不同温度、pH和变性剂对LCA凝血活性和荧光光谱的变化,当温度达80℃以上时,活性开始下降,100℃处理20分钟,LCA仍保留60%活性;pH为4—12对活性的影响不大,pH为2时,完全丧失活性;温度的升高和pH的改变对荧光光谱影响不大。表明LCA对热,酸碱具有较强的耐受性。 用荧光光谱法研究了三种变性剂脲、盐酸胍、SDS在不同浓度下构象的变化和凝血活性的变化情况。盐酸胍变性时,LCA荧光最大发射波长和荧光强度随盐酸胍浓度的增大而逐渐增大,其后随盐酸胍浓度的逐渐增大反而逐渐减小。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言：
• 2 材料和试剂
• 2.1 材料
• 2.2 试剂和仪器
• 3 方法
• 3.1 血细胞的处理
• 3.2 血凝活力的检测
• 3.3 LCA的分离纯化
• 3.3.1 粗品的制备
• 3.3.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析纯化LCA
• 3.3.3 分子筛层析
• 3.4 蛋白浓度的测定
• 3.5 LCA纯度鉴定
• 3.6 Sephacryl S-200分子筛层析测定表观分子量
• 3.7 凝集素基本理化性质检测
• 3.7.1 糖抑制实验
• 3.7.2 温度对LCA凝血活性的影响
• 3.7.3 PH对LCA凝血活性的影响
• 3.7.4 金属离子对LCA凝血活性的影响
• 3.7.5 变性剂对LCA凝血活性的影响
• 3.7.5.1 不同浓度盐酸胍对LCA凝血活性的影响
• 3.7.5.2 不同浓度脲对LCA凝血活性的影响
• 3.7.5.3 不同浓度SDS对LCA凝血活性的影响
• 3.7.6 甘露聚糖对LCA凝血活性的影响
• 3.8 LCA部分基团的化学修饰
• 3.8.1 Trp的修饰与数目测定
• 3.8.2 Tyr的修饰
• 3.8.3 巯基的修饰
• 3.8.4 羧基的修饰
• 3.8.5 Ser/Thr的修饰
• 3.8.6 二硫键修饰
• 3.8.7 组氨酸残基修饰
• 3.9 LCA的荧光光谱研究
• 3.9.1 天然态的荧光光谱
• 3.9.2 不同温度下荧光光谱
• 3.9.3 不同pH下的荧光光谱
• 3.9.4 色氨酸残基化学修饰后LCA的荧光光谱
• 3.9.5 变性剂对LCA荧光光谱的影响
• 3.9.5.1 盐酸胍对LCA荧光光谱的影响
• 3.9.5.2 不同浓度脲对LCA荧光光谱的影响
• 3.9.5.3 不同浓度SDS对LCA荧光光谱的影响
• 3.9.6 不同浓度甘露聚糖对LCA荧光光谱的影响
• 3.9.7 LCA的荧光淬灭研究
• 3.9.7.1 KI对LCA荧光的淬灭作用
• 3.9.7.2 丙烯酰胺对LCA的淬灭作用
• 3.9.7.3 氯化铯对LCA的淬灭作用
• 4 结果与分析
• 4.1 分离纯化、鉴定及分子量测定
• 4.2 LCA的性质检测结果
• 4.2.1 对血细胞凝集作用和糖抑制实验
• 4.2.2 天然态LCA的内源荧光光谱
• 4.2.3 LCA的耐热性测定
• 4.2.4 LCA耐酸碱测定
• 4.2.5 金属离子对LCA凝血活性和荧光的影响
• 4.2.6 变性剂对LCA活性及荧光光谱的影响
• 4.2.6.1 不同浓度脲
• 4.2.6.2 不同浓度盐酸胍对LCA性质的影响
• 4.2.6.3 不同浓度SDS对LCA性质的影响
• 4.2.7 化学修饰结果
• 4.2.7.1 色氨酸的修饰
• 4.2.7.2 LCA的酪氨酸（Tyr）残基修饰
• 4.2.7.3 LCA的二硫键和巯基修饰
• 4.2.7.4 LCA的Asp／Glu残基修饰
• 4.2.7.5 LCA的Ser／Thr残基修饰
• 4.2.7.6 LCA的His残基修饰
• 4.2.8 LCA荧光淬灭研究
• 4.2.8.1 KI的淬灭
• 4.2.8.2 丙烯酰胺的淬灭
• 4.2.8.3 CsCl的淬灭
• 4.2.9 甘露聚糖对LCA荧光光谱的影响
• 5.讨论：
• 参考文献
• 综述：甘露糖结合植物凝集素研究进展
• 前言
• 1、单子叶甘露糖结合凝集素家族
• 1.1 研究历史
• 1.2 存在，分子结构，氨基酸序列
• 1.2.1 存在及分布
• 1.2.2 天然凝集素的分子结构
• 1.3 结构，生物合成，翻译后修饰
• 1.4 糖结合专一性
• 1.5 凝集素相关蛋白的存在
• 1.6 三维结构
• 1.6.1 总的三维结构
• 1.6.2 识别单糖和复合糖的结构基础
• 1.6.3 相关蛋白的三维结构
• 1.7 分子进化
• 1.8 生理功能及应用
• 2.甘露糖结合豆科凝集素
• 2.1 糖专一性的结构基础
• 2.2 翻译后加工过程
• 2.3 生理功能和作用
• 3.甘露糖结合木菠萝相关凝集素
• 4.有甘露糖结合专一性的Ⅱ型核糖体失活蛋白
• 5.小结：
• 参考文献：
• 致谢
• 研究生阶段发表论文
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