新型毛细管液相色谱柱的研制及其相关应用

论文题目: 新型毛细管液相色谱柱的研制及其相关应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 分析化学

作者: 谷雪

导师: 张祥民

关键词: 溶胶凝胶,毛细管液相色谱,聚硅氧烷包覆硅胶,线性溶剂化相关能,预富集,阵列式,多维分离,蛋白质组学

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 毛细管液相色谱柱是微分离分析的核心，也是毛细管分析技术的瓶颈。研究新型、实用、专用的毛细管色谱柱，揭示其分离机制，且与相关技术相结合，始终是毛细管微分析的首要任务。溶胶凝胶(sol-gel)技术是色谱分析领域一种灵活多变的、简单易行的固定相制备技术。溶胶凝胶技术与包覆型复合填料制备结合，是一个全新的交叉点。传统包覆型复合填料制备过程中聚合物的固载化方法通常涉及自由基引发的交联反应，这种方法不易控制，交联重现性差。探索性地采用溶胶凝胶固载化技术将气相固定液包覆并固载在无机载体表面，制备出具有不同色谱选择性的复合型固定相，无疑有利于拓展溶胶凝胶技术的应用范围和开展相关复合型色谱柱保留行为的研究。溶胶凝胶技术与普通毛细管填充柱相结合，制备的细内径颗粒固定化无塞整体柱已在毛细管电色谱领域得到应用。在此基础上，开创性制备高性能大口径无开裂颗粒固定化无塞整体柱，并将其应用于复杂蛋白质组学样品的固相预富集，无论从柱制备技术还从应用范围，是一项创新性和实用性兼备的工作。发展高通量、高峰容量、高分辨率的新型蛋白质组学技术平台已成为当务之急。鉴于蛋白质组学样品的复杂性和现有二维液相／串级质谱体系有限的运行通量，建立一个新型的和实用性极强的蛋白质组学分析技术平台，无疑对蛋白质组学多维色谱技术的发展提供了有益的支持。本论文以溶胶凝胶技术制备毛细管色谱柱为核心，研究开发了新型实用的毛细管色谱柱，并在此基础上开展相关研究和应用工作。制备出气相固定液包覆硅胶复合型固定相，并与线性溶剂化相关能色谱理论相结合，研究其分离机理和色谱行为；制备了大口径颗粒固定化型无塞整体柱，对其作为肽段预富集柱的性能指标进行了测试和评价；搭建了蛋白质组学阵列式全多维色谱分离技术平台，将所制备预柱应用其中，提高和拓展多维色谱分离技术的分离性能。本论文共分五章。主要内容摘要如下：第一章总结了毛细管色谱柱的发展概况和溶胶凝胶技术在色谱固定相制备领域的应用及进展，同时概述了蛋白质组学多维色谱技术的发展及新型色谱柱与之相结合的应用前景。介绍了本论文选题的目的和意义。第二章开创性地采用溶胶凝胶法制备了气相固定液包覆硅胶复合型固定相。详细考察研究了制备中对色谱柱性能影响的主要因素，通过优化气相固定液的用量、溶胶凝胶前驱体的体积浓度和柱内反应时间及温度，确定了最佳包覆工艺条件，明确了用溶胶凝胶法进行聚合物包覆无机载体的可行性。以不同极性的的芳香族化合物为探针，测试评价了合成固定相的色谱性能。结果表明，所制备的复合型SE-30包覆硅胶固定相分离性能良好，柱效可达10000／m，耐碱性良好，对碱性化合物的分离存在一定程度的色谱峰拖尾。疏水选择性和绝对流动相灵敏度的检测表明，该固定相具有反相固定相保留的特征。第三章利用线性溶剂化相关能理论(LSERs)对不同气相固定液(SE-30，SE-54，OV-1701)包覆硅胶固定相的反相色谱行为分别做了研究，建立了线性良好的化合物保留预测方程，并与碳十八键合硅胶固定相的溶质保留行为做了比较。研究表明，气相固定液包覆硅胶固定相与碳十八键合硅胶固定相(ODS)在保留机理上有很大不同，溶解机理多于吸附机理。溶质的体积，偶极性／极化率，氢键给体酸性和氢键受体碱性共同成为决定溶质保留主要因素。另外固定液包覆硅胶固定相与溶质之间可以发生很强的π-π作用，因此它对强偶极性极化率的化合物选择性较高。由于保留机理不同，气相固定液包覆硅胶固定相和ODS固定相对于相同的化合物将表现出不同的选择性。无疑这对满足实际样品分析中复杂的分离要求提供了一个新的手段。另外，所制备固定相的选择性可通过改变包覆的聚合物的类型来控制，相比通常情况下反相液相色谱中只靠改变流动相配比来控制分离选择性，无疑具有机动灵活的优势。第四章用溶胶凝胶法以甲基三乙氧基硅氧烷为单一前驱体成功制备出了内径为320μm和530μm的大口径无开裂的颗粒固定化型无塞整体柱。首先对柱制备的溶胶凝胶配方和工艺条件进行了优化，摸索出的制作工艺简便易行，可靠性和可控性强，避免了批量装填短柱的繁琐和费时，提高了预柱制备重现性和批量生产可能性。其次，我们将其作为肽段预富集柱应用于多维液相色谱平台，对预富集柱的相关性能指标进行了测试和评价，探讨了最佳富集条件。建立了在线预富集／分离检测体系，利用六通阀将毛细管预柱与毛细管反相分离柱相连，联用紫外检测。结果表明，自制的320-μm-i．d．和530-μm-i．d．的预柱机械强度高，长度5mm即可耐压至300bar，且通透性良好。富集流速可达60μL／min，样品负载量高达70μg，回收率90％，浓度线性回归系数R~2=0.99，富集倍数达60倍。重复使用150次，重现性和化学稳定性依然良好。因此自制预富集柱能够方便快捷地实现肽段的除盐和高倍浓缩，极大改善了样品上样量、分析灵敏度和检测限，非常适合应用于二维液相色谱分离技术平台。第五章搭建了新型阵列式二维液相色谱分离-MALDI-TOF-TOF-MS检测技术平台，将自制预富集柱应用于样品的在线预处理，对人肝组织的蛋白质组进行了高效分离和检测。多通道式的并行接口模式使系统在第二维18根反相柱上实现并行式洗脱，使样品分析时间缩短18倍。该平台以强阳离子交换色谱(SCX)为第一维色谱分离模式，以反相液相色谱(RPLC)为第二维分离模式，可快速完成进样，浓缩除盐、分离及鉴定，实现真正的蛋白质组学研究所需的高通量分析。SCX柱采用阶梯式盐梯度洗脱，洗脱下来的组分通过两个十通阀的切换被依次保留在18个自制预富集柱的柱头，进行样品的浓缩和除盐。然后经多通道式接口被并行反冲到相应的反相色谱柱上，在18根反相色谱柱上同时完成色谱分离。色谱流出物通过一个自行设计加工的接口实现并行式点样到MAIDI靶板上(点样频率15s／次)，最后联用MALDI-TOF-TOF-MS快速鉴定。整个系统对300μg人肝蛋白酶解肽段进行了分离鉴定，共鉴定出462个蛋白。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 毛细管色谱固定相发展概况

1.2.1 有机聚合物填料

1.2.2 无机载体基质柱填料

1.2.3 有机-无机复合型柱填料

1.2.4 整体柱填料

1.3 溶胶凝胶技术在色谱固定相制备领域的应用及进展

1.3.1 溶胶凝胶技术

1.3.2 溶胶凝胶法制备毛细管色谱柱的基本原理

1.3.3 溶胶凝胶技术在毛细管填充柱的应用

1.3.4 溶胶凝胶技术在毛细管开管柱的应用

1.3.5 溶胶凝胶技术在毛细管整体柱的应用

1.4 多维色谱分离技术研究进展

1.5 毛细管液相色谱阵列分离技术进展

1.6 本论文选题目的和意义

参考文献

第二章 溶胶凝胶法制备气相固定液包覆硅胶固定相及色谱评价

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与材料

2.2.2 溶胶凝胶法制备 SE-30 包覆硅胶固定相

2.2.3 仪器

2.3 结果与讨论

2.3.1 Sol-gel法制备 SE-30包覆硅胶固定相的技术基础及原理

2.3.2 固定相制备工艺条件的优化

2.3.3 柱渗透性

2.3.4 柱性能评价

2.3.5 疏水选择性

2.3.6 绝对流动相灵敏度

2.3.7 对碱性化合物的分离

2.3.8 固定相的稳定性

2.4 结论

参考文献

第三章 线性溶剂化能相关理论评价气相固定液包覆硅胶固定相和碳十八键合硅胶固定相的色谱保留性质

3.1 引言

3.2 理论部分

3.2.1 分子间的作用能

3.2.2 线性溶剂化能相关理论

3.3 实验部分

3.3.1 仪器

3.3.2 色谱测试

3.3.3 被测化合物及结构参数

3.4 结果与讨论

3.4.1 保留数据的 LSERs 研究

3.4.2 LSERs系数分析

3.4.3 气相固定液包覆硅胶固定相与ODS固定相在不同作用贡献上的比较

3.5 结论

参考文献

第四章 大口径无塞型预富集微柱的制备及性能评价

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和材料

4.2.2 样品制备

4.2.3 色谱柱的填装

4.2.4 大口径无塞型预柱的制备

4.2.5 在线固相萃取预富集-毛细管反相液相色谱系统

4.3 结果与讨论

4.3.1 大口径无塞型预柱的制备

4.3.2 机械稳定性和通透性

4.3.3 富集条件的优化

4.3.3.1 富集流速的影响

4.3.3.2 样品负载容量

4.3.3.3 盐浓度的影响

4.3.3.4 线性关系和富集因子

4.3.3.5 回收率，重现性和化学稳定性

4.4 结论

参考文献

第五章 蛋白质组学阵列式全多维色谱分离技术的研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂与材料

5.2.2 样品制备

5.2.3 色谱柱的填装和大口径无塞型预柱的制备

5.2.4 阵列式二维液相色谱系统

5.2.5 串级质谱检测和数据库检索

5.3 结果与讨论

5.3.1 单通道毛细管二维液相色谱系统的工作原理和初步搭建

5.3.2 阵列式毛细管二维液相色谱/串级质谱平台的构建准则和策略

5.3.3 多通道并行式分流器和 LC-MALDI接口的设计和制作

5.3.4 色谱柱及管路的连接

5.3.4.1 柱连接

5.3.4.2 预柱与分流器中分流毛细管的连接

5.3.5 毛细管阵列式2D-LC/MS/MS系统实验条件的选择及优化

5.3.6 阵列式毛细管反相液相色谱系统的重现性

5.3.7 对人肝蛋白酶解肽段的分离和检测

5.4 结论与展望

参考文献

部分鉴定蛋白附表

在学期间发表和待发表论文

致谢

发布时间: 2007-06-27

参考文献

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