VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体的构建及表达

论文摘要

缺血性脑卒中是严重威胁人类健康和生命的神经系统常见疾病之一,目前尚缺乏有效的防治措施,随着生物技术的发展,基因治疗成为缺血性脑卒中研究者关注的焦点。VEGF在血管、中枢及外周神经系统中的作用已逐渐为人们所熟知,并进行了大量的实验研究,因此成为缺血性脑卒中基因治疗的理想因子。但近年来的研究发现,其治疗效果因给药途径、剂量、时间的不同而相差甚远,最佳的治疗条件仍有待大量的实验来证实,基于此本实验构建了VEGF 164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体,旨在为后续治疗条件的优化筛选提供实验基础。目的：构建VEGF164与EGFP双基因共表达的HIV-1慢病毒载体四质粒包装系统,经共转染293T包装细胞系,获得含有目的基因VEGF164与报告基因EGFP的优化新型HIV-1慢病毒载体。方法：①经RT-PCR方法扩增获得鼠源性VEGF164基因,克隆入pMD-18T载体中,得到质粒pMD18T-VEGF164;②分别对pHR’CMV-EGFP、pIRES2-EGFP进行双酶切及连接反应,构建质粒pHR’CMV-IRES2-EGFP;③分别对pMD18T-VEGF164、pHR’CMV-IRES2-EGFP进行酶切及连接反应,构建重组的载体质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP;④对重组的载体质粒进行限制性酶切鉴定并测序验证；⑤将构建好的载体质粒、pCMVΔ8.9 （包装质粒）、pCMV-VSV-G（包膜质粒）及pRSV-Rev四质粒共转染293T包装细胞系,收集细胞上清、高速离心获得慢病毒载体,并用RT-PCR、荧光显微镜观察监测质粒及慢病毒载体转染细胞后目的基因及报告基因的表达情况。结果：①RT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,可见三条明亮的条带,自上而下分别为645bp、573bp、441bp,分别对应VEGF188、VEGF164、VEGF121基因,进行目的片段的回收,获得了鼠源性VEGF164基因；②用限制性内切酶（Bam HI）对重组质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP进行酶切电泳,电泳图谱显示释放出约9.8Kb及573bp DNA片段,继而用限制性内切酶（BstⅪ+XhoⅠ）对该质粒进行双酶切电泳,电泳图谱显示释放出约9.7Kb及720bp DNA片段；③将质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP分别进行正反两向测序,与Genebank做对照,发现VEGF164序列上有一个碱基突变,但并不影响后期VEGF蛋白的表达；④四质粒共转染293T细胞,24小时后,荧光显微镜观察细胞呈现出绿色荧光,荧光强度在转染后48小时较强：收集的慢病毒载体再次感染293T细胞,48小时后,细胞亦呈现出绿色荧光,且每一视野EGFP阳性细胞可达70%左右,提取感染后293T细胞的总RNA,进行RT-PCR反应,可见VEGF164感染组有目的基因的表达,对照组未见阳性表达。结论：①成功的从Wistar大鼠血液中提取了总RNA, RT-PCR反应扩增获得了鼠源性VEGF164基因,并测序验证成功；②经连接反应,构建了重组的载体质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP,并经酶切电泳证实构建成功；③成功构建了VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体。本实验成功构建了VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体四质粒包装系统,经共转染293T细胞系,收集细胞上清,高速离心获得了高滴度的优化新型HIV-1慢病毒载体,实现了VEGF164目的基因的表达,同时以EGFP基因作为报告基因可以直接观察目的基因在细胞内的表达情况,也有利于将来在活体基因治疗中进行体内或体外示踪研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 第2章 文献综述
• 2.1 VEGF及其受体
• 2.2 VEGF的生物学作用
• 2.3 VEGF对缺血性脑卒中的保护作用
• 2.4 VEGF的治疗现状
• 2.5 前景与问题
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 第4章 结果
• 4.1 鼠源性VEGF164基因片段的获得
• 4.2 质粒酶切鉴定
• 4.3 目的片度测序
• 4.4 转染包装细胞及目的基因的表达
• 第5章 讨论
• 5.1 VEGF基因的选择
• 5.2 转基因载体的选择
• 5.3 基因共表达的实现
• 第6章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢