淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义

论文摘要

淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义研究背景再生障碍性贫血（再障，Aplastic Anemia，AA）发病机理较为复杂，近来认识到免疫机制紊乱尤其是淋巴细胞免疫功能紊乱在再障发病中的作用，己成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells，BMMSCs）作为骨髓基质细胞的起源细胞细胞，BMMSCs及其分化成的细胞在再障发病过程中的作用鲜有研究报道。红髓脂肪化是再障特征性病理改变。但对于再障骨髓中的脂肪组织增多原因及作用尚未见到相关报道。一直以来，脂肪组织被认为是单纯的能量储存组织。然而随着一些脂肪细胞分泌的因子被人们发现，脂肪细胞的其他重要生理学功能被逐渐发掘出来。数十种脂肪细胞分泌因子（adipocyte-secreted factors）在近10余年来已被相继发现，并引起广泛重视。这些因子被统称为脂肪细胞因子（adipocytokines）或简称脂肪因子（adipokines）。目前认为脂肪组织是有独特组织类型，具有特定功能（例如，平衡能量储备、分泌激素和调节免疫）的真正器官系统。Leptin和Adiponectin是脂肪组织参与免疫调节反应的两个主要的脂肪因子。Leptin对T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞都具有免疫调节作用。免疫细胞受到免疫刺激后，产生细胞因子（尤其是TNF-α）作用于脂肪细胞，使其分泌Leptin，从而达到使免疫信号扩大化的目的。Adiponectin是脂肪细胞表达最丰的激素。主要在天然免疫效应中发挥作用，能抑制髓单核细胞祖细胞的增殖，抑制巨噬细胞的活性。因此，与Adiponectin不同，对于造血免疫系统，Adiponectin被看作是一种负调控因素，可能参与炎症反应的终止。异常的免疫反应可能在损伤造血干细胞的同时对BMMSCs也具有损伤作用，对BMMSCs的脂肪分化能力产生一定的影响，骨髓内显著增多的脂肪细胞也可能对免疫系统有一定的作用。我们对此进行以下研究，以期从一个新的角度探索再生障碍性贫血的发病机制。目的（1）体外分离、培养、扩增小鼠BMMSCs，并研究其生物学特点。（2）培养、扩增再障患者和正常对照BMMSCs，比较两组BMMSCs生物学特性及脂肪分化能力的不同。（3）建立免疫相关骨髓衰竭动物模型，观察免疫紊乱条件下模型小鼠骨髓脂肪化程度的改变，并研究该模型BMMSCs的生物学特性。（4）研究同基因条件下，活化淋巴细胞对BMMSCs向脂肪分化能力的影响及BMMSCs向脂肪细胞分化后对单个核细胞（MNCs）增殖及活化状态的影响。方法（1）贴壁筛选法分离纯化BALB／c小鼠BMMSCs，胰酶消化传代，FCM鉴定细胞表型，并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。（2）体外密度梯度离心法分离培养正常人和再障患者的BMMSCs，观察其形态学的异同，同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原以及RT-PCR法检测成脂肪细胞的差异。（3）C57BL/6小鼠（父本）和BALB／c小鼠（母本）杂交产生CByB6F1小鼠，将F1小鼠γ射线亚致死量照射（4．5Gy）后尾静脉注射母本淋巴细胞，建立免疫相关骨髓衰竭动物模型。记录白细胞，红细胞，血小板及血红蛋白的变化，股骨切片HE染色观察模型小鼠骨髓脂肪化程度，贴壁筛选法分离小鼠BMMSCs，观察其生物学特性的改变。（4）将Percoll密度梯分离BALB／c小鼠脾脏MNCs，ConA活化后与BALB／c小鼠BMMSCs共培养72小时，Real-time PCR，Western Blot及ELISA检测BMMSCs脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化。BMMSCs诱导分化成脂肪细胞，与脾MNCs共培养72小时，CCK-8检测MNCs增殖，流式检测淋巴细胞活化标志的变化。结果（1）BMMSCs呈梭形或三角形，长梭形，细胞排列整齐，低倍镜下部分呈平行状或旋涡状。流式检测BMMSCs高表达CD44，CD73，CD90和CD105，低表达或不表达CD14，CD34，CD45及HLA-DR。在特定的诱导条件下，BMMSCs能向脂肪细胞，成骨细胞及软骨细胞分化。（2）在起始培养细胞数相同条件下，初次换液时再障患者形成的克隆数明显少于正常对照[（19．3±4．77）／5×105 MNCs vs（47．72±3．46）／5×105 MNCs，（P＜0．05）]，再障组和正常对照BMMSCs细胞形态和表面标志无明显差别，体外再障患者BMMSCs向脂肪细胞诱导分化较正常组早。（3）CByB6F1小鼠亚致死量照射后，骨髓衰竭为可逆性，外周血象在第10天开始恢复，约6周恢复至正常水平，而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠，外周血象降低为不可逆性，造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭，免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚，脂肪组织明显增多，而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。体外培养证实，与对照组相比，免疫相关骨髓衰竭组小鼠BMMSCs增殖能力降低，不能传代。（4）体外培养，BALB／c小鼠BMMSCs与经ConA活化的BALB／c小鼠脾脏的MNCs按1：5比例共培养72小时，Real-time PCR检测发现，BMMSCs的Leptin基因表达明显增加而Adiponectin基因表达轻度降低，Western Blot检测该两种蛋白表达也有近似的趋势。ELISA定量检测共培养上清中这两种蛋白的表达发现，Leptin低于检测下限而Adiponectin则明显减少。将BALB／c小鼠的脾MNCs与其BMMSCs或脂肪分化的BMMSCs按一定比例共培养，BMMSCs：MNCs为1：0．5时，脂肪分化的BMMSCs组的淋巴细胞增殖抑制作用显著低于正常对照组BMMSCs[正常对照组vs脂肪分化组为-（77．8±20．7）％vs-（47．8±14．3）％，（P＜0．05）]；而其比例相当（BMMSCs：淋巴细胞为1：1）时，脂肪分化的BMMSCs组对淋巴细胞的作用为轻度促增殖，但与正常对照组的轻度抑制增殖作用相比，差异无显著性[正常对照组vs脂肪分化组为-（28．3±5．2）％vs（3．3±4．9）％，（P＞0 05）]；当淋巴细胞数量逐渐增多，超过BMMSCs数量时，脂肪化的BMMSCs组就表现为促淋巴细胞增殖作用[正常对照组vs脂肪分化组为1：2．5时（-3．9±8．3）％vs（34．2±17．1）％，（P＜0．05）；1：5时（9．4±8．8）％vs（40．8±16．3）％（P＜0．05）；1：10时（20±14．9）％vs（65．8±12．5）％（P＜0．05）]，而且该作用在一定比例范围内，随着淋巴细胞数量的增多而逐渐增强。脂肪分化的BMMSCs与MNCs共培养72h后，却能使淋巴细胞的活化标志CD25和CD69表达与正常对照组相比明显增增加[脂肪分化BMMSCs共培养组vs正常BMMSCs共培养组：CD25+（50．9±7．7）％vs（16．2±5．7）％，（P＜0．05）；CD69+（47．3±5．8）％vs（13．3±4．6）％（P＜0．05）]。结论（1）全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。（2）再障患者BMMSCs形态与正常对照相比无明显变化，但其增殖能力较正常对照降低，而且脂肪细胞分化早于正常对照。（3）CByB6F1小鼠在亚致死量照射后，骨髓衰竭为可逆性，经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭，形成免疫相关骨髓衰竭动物模型，模型动物骨髓脂肪组织明显增多，BMMSCs增殖能力降低，不能传代，对照组却无此种改变。（4）ConA活化的淋巴细胞能促进BMMSCs脂肪分化相关基因的表达，且脂肪因子分泌失调，Leptin增加而Adiponectin减少。当BMMSCs诱导分化为脂肪细胞后，与MNCs共培养，可检测到淋巴细胞早期活化标志CD25和CD69表达的增加，提示BMMSCs脂肪分化后，具有刺激淋巴细胞活化的作用。（5）我们的实验提示，活化淋巴细胞能促进BMMSCs脂肪分化，BMMSCs脂肪分化后能刺激淋巴细胞增殖及活化，二者形成恶性循环。此现象可能在再障的发生发展中起一定的作用，有待后期实验进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞成脂肪分化能力的变化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 免疫相关骨髓衰竭动物模型的制备及其骨髓脂肪化观察
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 淋巴细胞活化与BMMSCs脂肪化之间的相互关联
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文主要结论
• 展望
• 参考文献
• 英文缩写对照表
• 附录
• 附录一 综述
• 附录二 发表文章及获奖情况
• 致谢