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扇贝、对虾基因组BAC文库构建及其重要功能基因的初步筛选和分析

2020-11-29阅读(365)

扇贝、对虾基因组BAC文库构建及其重要功能基因的初步筛选和分析

论文摘要

基因组大片段BAC文库是进行生物遗传学和基因组学研究必不可少的基础工具。为了深入开展栉孔扇贝(Chlamys farreri)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)基因组学研究、阐明其基因组的结构与功能、图位克隆重要功能基因、构建高密度物理图谱并最终实现与已有遗传连锁图的整合,本研究在植物基因组BAC文库构建技术的基础上,针对海洋生物的特点进行了大胆的改革与尝试,最终成功构建了C. ferrari和L. vannamei两种重要海水养殖动物的基因组BAC文库。本文构建的栉孔扇贝基因组BAC文库,由BamHI文库和MboI文库构成。其中BamHI文库含有73,728个BAC克隆,空载率约为1%,平均插入片段约为110 kb,覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约8倍;MboI文库共有7,680个克隆组成,平均插入片段大小约为145 kb,插入率为100%,覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约1.1倍。两个栉孔扇贝基因组BAC文库共由81,408个克隆组成,平均插入片段约为113 kb,覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组大小的9.1倍。将栉孔扇贝基因组BAC文库的192个384微孔培养板中的73,728个BAC克隆以4 x 4点阵形式制备了高密度DNA薄膜,用于对感兴趣的基因及DNA序列的筛选。高密度DNA薄膜的覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组的8.3倍。针对栉孔扇贝先天免疫系统通路的6个重要功能基因,根据栉孔扇贝cDNA序列以及异缘物种DNA序列设计了Overgo探针。利用Overgo探针对高密度DNA薄膜杂交筛选的结果显示,平均每个基因检测到7.3个潜在阳性克隆。本研究所构建的凡纳滨对虾基因组HindIII酶切BAC文库共有102,528个BAC克隆,存放于267个384微孔培养板中,平均插入片段大小约为101 kb,空载率约为5%,覆盖L. vannamei单倍体基因组约5倍。将其中240个384微孔培养板中的92,160个BAC克隆以4 x 4的矩阵排列形式制作了5张高密度凡纳滨对虾DNA薄膜,约覆盖整个对虾单倍体基因组的4.5倍。针对6个与对虾免疫、生殖生理有关的重要功能基因设计了Overgo探针,杂交筛选出20个阳性克隆,平均每个基因有3.3个潜在阳性克隆。以上筛选结果不仅为进一步研究这些功能基因的结构与功能、表达与调控,揭示它们在扇贝和对虾以及其他近缘种的免疫系统、抗逆和生殖生理过程中的作用机理打下了基础,同时也间接验证了栉孔扇贝和凡纳滨对虾基因组BAC文库将成为基因筛选、基因的结构与功能分析、基因图位克隆、物理图谱构建以及大规模全基因组测序等方面的有力工具。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一章 基因组研究的关键平台——大片段基因组文库
  • 第一节 大片段基因组文库的发展
  • 1.1.1 概述
  • 1.1.2 细菌人工染色体（BAC）及其衍生载体系统
  • 第二节 大片段基因组文库的构建与鉴定
  • 1.2.1 文库的构建
  • 1.2.2 文库的鉴定
  • 第三节 大片段基因组文库在物理图谱构建以及海洋生物研究中的应用
  • 1.3.1 物理图谱构建策略
  • 1.3.2 大片段基因组文库展望以及在海洋生物研究中的应用
  • 第二章 DH10B菌株高效电转化条件探究
  • 第一节 材料与方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 方法
  • 第二节 实验结果
  • 2.2.1 脉冲场强对pUC19 DNA转化效率的影响
  • 2.2.2 质粒DNA的大小对转化效率的影响
  • 2.2.3 混合质粒DNA的转化效率
  • 第三节 讨论
  • 本章小结
  • 第三章 栉孔扇贝（Chlamys farreri Jones et Preston）基因组BAC文库的构建以及免疫相关功能基因的筛选和分析
  • 第一节 栉孔扇贝基因组BAC文库的构建
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 BAC载体pECBAC1 的制备
  • 3.1.3 高分子量（High-molecular-weight, HMW）DNA提取
  • 3.1.4 C. farreri基因组BAC文库的构建
  • 第二节 栉孔扇贝基因组BAC文库的质量鉴定和分析
  • 3.2.1 栉孔扇贝基因组BAC文库插入片段大小分析与文库保存
  • 3.2.2 栉孔扇贝基因组BAC文库稳定性检测
  • 第三节 栉孔扇贝免疫相关功能基因的筛选及阳性BAC克隆的鉴定和分析
  • 3.3.1 栉孔扇贝的免疫系统
  • 3.3.2 栉孔扇贝BAC文库高密度DNA薄膜的制备
  • 3.3.3 Overgo（Overlapping oligonucleotides）探针杂交原理
  • 3.3.4 栉孔扇贝免疫相关重要功能基因Overgo探针的设计
  • 3.3.5 放射性同位素杂交
  • 第四节 实验结果与分析
  • 3.4.1 BAC载体pECBAC1 的制备和纯化
  • 3.4.2 栉孔扇贝基因组BAC文库的构建
  • 第五节 讨论
  • 本章小结
  • 第四章 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组BAC文库的构建以及重要功能基因的筛选
  • 第一节 凡纳滨对虾（Litopenaeus. vannamei）基因组BAC文库的构建
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 BAC载体pECBAC1 和pCLD04541 的制备
  • 4.1.3 凡纳滨对虾（L. vannamei）高分子量（High-molecular-weight, HMW）DNA提取
  • 4.1.4 凡纳滨对虾基因组BAC文库的构建
  • 第二节 凡纳滨对虾基因组BAC文库的质量鉴定
  • 4.2.1 L. vannamei基因组BAC克隆插入片段大小分析与文库保存
  • 4.2.2 凡纳滨对虾基因组BAC文库稳定性检测
  • 4.2.3 凡纳滨对虾BAC文库高密度DNA薄膜的制备
  • 4.2.4 重要功能基因Overgo探针的设计
  • 4.2.5 放射性同位素杂交
  • 第三节实验结果与分析
  • 4.3.1 载体pECBAC1 与pCLD04541 DNA的制备和纯化
  • 4.3.2 凡纳滨对虾基因组BAC文库的构建
  • 第四节 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 博士在读期间发表的文章
  • 致谢

    • 相关论文文献

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