拟南芥AtSCAMP家族的功能研究

论文摘要

盐胁迫是威胁世界粮食产量的重要因素之一。土壤盐渍化问题在中国更为突出。研究植物耐盐相关基因对于认识植物耐盐机理,改良植物耐盐性有着至关重要的作用。小麦是我国的主要粮食作物,研究小麦耐盐基因对于我国的粮食安全有着深刻的意义。近几年,随着研究的不断深入,众多小麦耐盐基因不断被发现。但是由于小麦的基因组庞大,及生长周期长,以小麦为研究本体困难重重。通过研究拟南芥中的小麦同源基因,可以快速有效地达到研究目的。并验证了TaSCAMP1与液泡膜Na+/H+逆转运蛋白的相互作用。本论文则是在前人实验结果的基础上,验证拟南芥中SCAMP家族与Na+/H+逆转运蛋白之间的相互作用。拟南芥中的SCAMP家族共有5个成员,由于大部分没有确切的名称,为了方便描述我们以其ORF的全长碱基数为其命名,分别是ATSCAMP849 （AT2G20840）、ATSCAMP870 （AT1G61250）、ATSCAMP876 （AT1G11180）、ATSCAMP852 （AT1G03550）和ATSCAMP795 (AT1G32050夕。拟南芥中的Na+/H+逆转运蛋白主要在液泡膜和质膜上。液泡膜上的Na+/H+逆转运蛋白有六个,分别是AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、NtNHX4、AtNHX5和AtNHX6。质膜上的Na+/H+逆转运蛋白是AtNHX7（又名SOS1）。我们已经克隆出拟南芥Na+/H+逆转运蛋白基因并构建BiFC载体4个,拟南芥SCAMP家族基因已克隆出4个并构建BiFC载体。并用BiFC分别两两验证了这4个Na+/H+逆转运蛋白和4个SCAMP之间的相互作用。BiFC结果显示,AtNHX2与AtSCAMP849之间有相互作用,AtNHX1与AtSCAMP849、AtNHX1与AtSCAMP876、AtNHX2与AtSCAMP876之间没有发现有激发荧光。由于AtNHX3、AtNHX6与pSPYCE空对照有自发荧光,AtSCAMP795、AtSCAMP870与pSPYNE空对照有自发荧光,所以不能判断它们与其他蛋白之间是否有相互作用。对于空对照有自发荧光的基因,我们将调换其载体或使用其他策略以期能够消除自发荧光。为了确保AtNHX2与AtSCAMP849之间相互作用的真实性,我们采用传统酵母双杂交技术对其进行了验证。结果显示,AtNHX2与AtSCAMP849并没有相互作用。我们分析原因有二：一是BiFC的结果是假阳性,看到的可能是自发荧光。二是这两个蛋白不适用于传统酵母双杂交系统。因为AtNHX2和AtSCAMP849是膜蛋白,可能会导致传统酵母双杂交系统中的转录因子不能进核,故而不能激活报告基因。为了排除第二种可能,我们又选用分离泛素酵母双杂系统（]mbSUS）验证AtNHX2与AtSCAMP849是否有相互作用,通过酵母生长实验,实验组在三缺培养基中生长状态良好,阴性对照组没有生长,说明AtNHX2与AtSCAMP849之间存在相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引文
• 1 文献综述
• 1.1 NHX家族基因的研究
• 1.1.1 Na+/H+逆向转运蛋白的分子组成和分类
• 1.1.2 拟南芥NHX基因（AtNHX）的功能与调控
• 1.2 SCAMP家族的基因的研究
• 1.3 几种常用蛋白质相互作用方法概述
• 1.3.1 通过酵母双杂交验证蛋白质之间的相互作用
• 1.3.2 分离泛素酵母双杂交系统
• 1.3.3 双分子荧光互补技术
• 2. BiFC验证拟南芥NHX家族与SCAMP家族相互作用
• 2.1 实验材料、试剂及设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 AtNHX家族与AtSCAMP家族引物设计
• 2.2.2 拟南芥的培养及盐处理
• 2.2.3 RNA提取
• 2.2.4 RNA的鉴定
• 2.2.5 RNA反转录
• 2.2.6 PCR扩增
• 2.2.7 PCR产物的回收、末端加A与连接转化
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.9 连接产物的转化
• 2.2.10 质粒的快速提取
• 2.2.11 碱裂解法提取质粒
• 2.2.12 序列测定
• 2.2.13 序列的比较和分析
• 2.2.14 BIFC载体的构建
• 2.2.15 农杆菌的转化及阳性克隆的鉴定
• 2.2.16 农杆菌介导的烟草注射
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 AtNHX家族与AtSCAMP家族基因的扩增
• 2.3.2 构建AtNHX家族与AtSCAMP家族基因BiFC表达载体
• 2.3.3 农杆菌转化及鉴定
• 2.3.4 农杆菌介导的烟草注射
• 2.4 讨论
• 3. 酵母双杂验证拟南芥AtNHX2与AtSCAMP849相互作用
• 3.1 实验材料、试剂及设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 AtNHX2与AtSCAMP849酵母双杂引物设计
• 3.2.2 PCR扩增
• 3.2.3 PCR产物的回收、末端加A与连接转化
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 质粒的快速提取
• 3.2.7 碱裂解法提取质粒
• 3.2.8 序列测定
• 3.2.9 序列的比较和分析
• 3.2.10 酵母双杂交系统载体的构建
• 3.2.11 小量制备酵母感受态细胞
• 3.2.12 LiAc介导的质粒DNA转化酵母细胞
• 3.2.13 诱饵蛋白自激活特性鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 双杂交系统相关基因的扩增
• 3.3.2 构建酵母双杂交系统表达载体
• 3.3.3 载体转化酵母及相互作用验证
• 3.4 讨论
• 4. mbSUS验证拟南芥AtNHX2与AtSCAMP849相互作用
• 4.1 实验材料、试剂及设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 生物信息学分析
• 4.2.2 PCR扩增
• 4.2.3 PCR产物的回收、末端加A与连接转化
• 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.5 连接产物的转化
• 4.2.6 质粒的快速提取
• 4.2.7 碱裂解法提取质粒
• 4.2.8 序列测定
• 4.2.9 序列的比较和分析
• 4.2.10 片段和载体酶切回收
• 4.2.11 酵母感受态的制备及小量转化
• 4.2.12 分离泛素系统载体构建
• 4.2.13 mbSUS验证蛋白相互作用
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 生物信息学分析
• 4.3.2 mbSUS相关基因的克隆
• 4.3.3 酵母转化子的鉴定
• 4.3.4 mbSUS验证蛋白相互作用
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢