水稻OsPDCD5基因的功能研究和应用及油菜csRRM2结构域在棉花中的功能鉴定

论文摘要

细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）是指受到严格控制并且主动有序的细胞死亡。这一过程对于机体防御反应,限制病原菌扩散以及多细胞生物个体的正常生长发育至关重要。PDCD5 （programmed cell death 5）基因参与细胞程序性死亡的调控并且在进化过程中非常保守。OsPDCD5基因是我们通过水稻分化和未分化的愈伤组织间的抑制消减杂交（SSH）分离得到PDCD5的同源基因。在之前的研究中,我们发现组成型过表达OsPDCD5的水稻转基因再生植株直到三叶期才逐渐死亡,为了研究其原因是因为转基因植株的OsPDCD5表达量在三叶期前不足以诱导细胞死亡,还是因为幼嫩的植株具有某种可以抑制细胞死亡的机制,我们构建了一个可以通过热激来诱导OsPDCD5表达的系统。从细菌到人类都具有合成热激蛋白（HSPs）的能力,它们在有机体受到高温胁迫（热激）时大量表达。Oshsp 16.9C （Accession No. U81385）是一种水稻|型低分子量HSP基因,它在28℃时基本没有转录,但在41℃热激诱导2小时后转录水平显著增加。将Oshsp 16.9C启动子驱动的OsPDCD5转化籼稻品种"9311”和粳稻品种“中花11”,所获得的转基因植株在28℃时可以正常生长,但在生长发育的任何阶段都可以通过41℃热激处理来诱导OsPDCD5的表达,使得我们可以对其诱导的细胞死亡进行详细的系统研究。结果表明OsPDCD5只能在三叶期及以后的植株中诱导细胞死亡,植株表现出生成枯斑,叶片枯萎,DNA片断化,产生过氧化物以及线粒体膨胀等症状。芯片结果显示很多PCD相关基因的转录水平都明显改变,其中包括Bcl-2-associated athanogene （BAG）家族基因以及可以在酵母和拟南芥中诱导PCD的AtBAG6的同源基因。但是OsPDCD5在二叶期及以前的植株中却不能诱导细胞死亡,并且没有导致任何症状。芯片结果和实时定量PCR的结果表明Bax inhibitor-1基因和一个ubiquitin基因与此现象密切相关,表明幼嫩植株确实拥有抑制OsPDCD5诱导的细胞死亡的机制。综合之前的结果和本次的实验数据,我们推测OsPDCD5可能通过影响钙离子平衡继而导致线粒体功能障碍这一途径来参与PCD通路的调控。OsPDCD5具有重要的实际应用价值：在非光敏的籼稻品种金23B中反义表达OsPDCD5,转基因植株的抽穗期推迟,叶片衰老延缓,产量明显提高；OsPDCD5的诱导表达系统可以用于无标记转基因株系的获取。棉花是一种重要的经济作物,它是天然纤维的主要来源,还是重要的油料作物。棉花有八千年的种植历史,是世界经济的重要组成部分。提高棉纤维的产量和品质是棉花育种的主要目标。棉纤维更准确地生物学名称是毛状体,因为它们是从胚珠表皮生成的,并不属于维管组织。虽然大多数植物的毛状体都是多细胞结构,棉纤维却是由单细胞构成的。由于棉纤维高度伸长,因此它的长度在一定程度上可以直接反映细胞的大小。棉纤维的长度对纱线的强度和均匀度以及纺纱的效率都有影响。因此,棉纤维的长度在影响棉花产量的同时,还影响棉花的品质。单细胞棉纤维的长度和受稳态调控的细胞大小直接相关,主要由基因型决定。在之前的研究中,我们发现水稻开花控制基因FCA的RNA recognition motif （RRM）FCA-RRM1和FCA-RRM2的过表达都具有增大细胞大小和提高产量的功能,这说明FCA-RRM1和FCA-RRM2可能参与细胞大小的调控。同时,它们在进化中都表现出了高度的保守性,暗示FCA-RRM2在不同植物中可能具有相似的功能。在油菜中过表达油菜FCA-RRM2（Bn-csRRM2）基因的结果证明了这一推论（未发表）。为了验证B门一csRRM2的跨种保守性,我们又将其用于转化棉花,结果显示Bn-csRRM2在棉花中也能起作用,暗示csRRM2可能是一个古老且普遍的细胞大小调控因子。虽然csRRM2调控细胞大小的机制尚未明了,但是它提供了一条解决细胞大小问题的途径,同时还使得转基因棉花的品质和产量显著提高,具有重大的经济价值。由于csRRM2氨基酸序列的高度保守性,我们推测它可能在小麦,杨树和l蓖麻等植物中也起到增加产量的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一.前言
• 1.1 OsPDCD5
• 1.1.1 PCD概述
• 1.1.2 植物PCD
• 1.1.2.1 动物PCD相关基因的植物同源基因
• 1.1.2.2 植物特有的PCD基因
• 1.1.3 PDCD5
• 1.1.4 线粒体与PCD
• 1.1.4.1 MPTP
• 1.1.4.2 细胞色素c
• 1.1.4.3 ROS
• 1.1.5 caspases
• 1.1.6 类caspases
• 1.1.6.1 VPEs
• 1.1.6.2 metacaspases
• 1.1.6.3 saspases
• 1.1.7 钙离子与植物PCD
• 1.1.8 植物PCD检测方法
• 1.2 Bn-csRRM2
• 1.2.1 FCA的RRM结构域具有使细胞增大的功能
• 1.2.2 棉花概述
• 二. 材料与方法
• 2.1 水稻品种
• 2.2 质粒及菌株
• 2.3 试剂盒
• 2.4 水稻cDNA的获取
• 2.4.1 水稻总RNA的提取和纯化
• 2.4.2 反转录反应
• 2.5 水稻基因组DNA的小量提取
• 2.6 棉花基因组DNA的小量提取
• 2.7 目的片段的克隆
• 2.7.1 引物设汁及片段扩增
• 2.7.2 回收PCR产物条带
• 2.7.3 将目的片段连接至pGEM-T载体
• 2.7.4 质粒DNA的转化
• 2.8 载体构建
• 2.8.1 质粒DNA的制备及纯化
• 2.8.2 质粒DNA目的片段的酶切
• 2.8.3 目的片段的回收与连接
• 2.9 水稻基因枪转化
• 2.9.1 培养基
• 2.9.2 试剂与器具
• 2.9.3 转化方法
• 2.10 棉花基因枪转化
• 2.10.1 转基因再生苗的获取
• 2.10.2 嫁接及种子的获取
• 2.11 转基因阳性植株的鉴定
• 2.11.1 利用PCR方法鉴定转基因植株
• 2.11.2 Southern杂交分析
• 2.12 石蜡切片
• 2.12.1 载玻片和盖玻片处理
• 2.12.2 材料固定与包埋
• 2.12.3 切片的展片和粘片
• 2.12.4 脱蜡、染色、脱水
• 2.12.5 封片
• 2.13 RNA原位杂交
• 2.13.1 切片准备
• 2.13.2 原位杂交程序
• TM荧光法TUNEL检测系统'>2.14 DeadEnd^TM荧光法TUNEL检测系统
• 2.14.1 检测原理
• 2.14.2 器材与试剂
• 2.14.3 实验步骤
• 2.15 实时定量PCR（RT-qPCR）
• 2O₂）的测定'>2.16 植物细胞过氧化氢（H₂O₂）的测定
• 2.17 透射电镜（TEM）
• 2.18 基因芯片（Agilent Rice Oligo Microarrays）
• 三. 结果与讨论
• 3.1 OsPDCD5
• 3.1.1 构建OsPDCD5的热激诱导表达系统
• 3.1.2 转基因植株热激诱导OsPDCD5转录的表型
• 3.1.3 OsPDCD5诱导的细胞死亡具有多种PCD的特性
• 3.1.3.1 基因组DNA断裂
• 3.1.3.2 ROS生成
• 3.1.3.3 线粒体膨大
• 3.1.3.4 OsPDCD5与绒毡层发育过程中的PCD
• 3.1.4 幼嫩植株可以抑制OsPDCD5诱导的细胞死亡
• 3.1.5 芯片分析
• 3.1.5.1 三叶期
• 3.1.5.2 二叶期
• 3.1.6 反义表达OsPDCD5可提高水稻产量
• 3.1.7 OsPDCD5诱导表达用于筛选无标记转基因植株
• 3.1.7.1 转基因作物的安全隐患
• 3.1.7.2 无标记转基因作物的获取
• 3.1.7.3 OsPDCD5诱导表达用于筛选无标记转基因植株
• 3.2 Bn-csRRM2
• 3.2.1 Bn-csRRM2棉花转基因植株的获取
• 3.2.2 Bn-csRRM2导致转基因棉花植株增大
• 3.2.3 Bn-csRRM2导致转基因棉花器官增大
• 3.2.4 Bn-csRRM2导致转基因棉花细胞增大
• 3.2.4.1 棉纤维
• 3.2.4.2 花粉细胞
• 3.2.4.3 子叶柄细胞
• 四. 补充材料
• 4.1 Supplemental Figure 1
• 4.2 Supplemental Figure 2
• 4.3 Supplemental Figure 3
• 4.4 Supplemental Figure 4
• 4.5 Additional file 1
• 4.6 Additional file 2
• 4.7 Additional file 3
• 4.8 Additional file 4
• 参考文献
• 攻读学位期间研究成果
• 致谢