论文摘要
[研究背景与目的]肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见肿瘤,每年死于HCC患者人数超过500,000例。近年来HCC的治疗理念、策略、模式、技术乃至医疗组织结构都经历了重大演变。尽管多专科和多元化治疗模式显著改变了HCC的治疗效果,但HCC治疗仍然面临着严峻的挑战。早期发生的门静脉侵袭和肝内转移,是肝癌病人手术后复发率高,预后差的最重要原因之一。目前肝细胞癌的侵袭和转移机制还不很清楚,因此探索肿瘤侵袭和转移的机制、寻找抑制肿瘤侵袭和转移的有效靶点,一直是国内外研究的热点。葡萄糖调节蛋白78（Grp78）是内质网合成分泌的一种多功能蛋白质,对于折叠、成熟、转运蛋白质到细胞外发挥重要的作用。许多研究表明在肿瘤的发生和发展过程中伴随着Grp78表达和功能的改变。最近的研究揭示了Grp78在转移肿瘤表面表达,并且增高的Grp78表达与淋巴结转移程度密切相关,这表明Grp78在肿瘤的侵袭和转移中可能发挥重要的调节作用。本研究旨在应用免疫组织化学方法在人肝细胞癌组织中检测Grp78,FAK的表达,并应用小干扰RNA（siRNA）技术特异性下调Grp78在肝癌细胞株BEL7402中的表达,探讨Grp78在肝细胞癌侵袭和转移中的作用及分子机制。[实验方法]一、肝癌组织中Grp78和FAK表达的相关性研究应用免疫组织化学方法检测44例人肝细胞癌手术切除组织中Grp78,FAK的表达及tyr397的磷酸化情况。每个组织标本取3张切片,每张切片随机选取10个高倍视野进行观察、评分,统计学分析。二、特异性下调Grp78对肝细胞癌侵袭和转移的影响通过siRNA技术特异性下调人肝细胞癌细胞株BEL7402中Grp78的表达,应用Transwell法和划痕法对肝细胞癌侵袭、转移能力的改变进行分析;应用免疫沉淀技术和GST-pulldown技术分别对FAK的磷酸化水平和小GTPase RhoA的活性进行研究;应用免疫印迹技术检测E-钙黏素,N-钙黏素和波形蛋白（Vimentin）的表达。三、特异性下调Grp78抑制肝细胞癌侵袭和转移的分子机制通过siRNA技术特异性下调人肝细胞癌细胞株BEL7402中Grp78的表达,应用细胞黏附实验和细胞伸展实验观察特异性下调Grp78对细胞黏附特性和细胞极性形成的影响;应用明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性;用免疫印迹实验检测细胞外基质重构相关蛋白基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）的表达以及转录因子c-jun的表达及磷酸化状态。[实验结果]一、肝癌组织中Grp78和FAK表达的相关性研究应用免疫组织化学方法检测44例人肝细胞癌组织中Grp78、FAK的表达情况,结果显示Grp78、FAK表达与肝癌细胞的分化程度呈负相关（r=0.456,P=0.001;r=0.312,P=0.039）。研究结果还显示在44例肝细胞癌中Grp78和FAK呈正相关（r=0.434,P=0.001）。anti-FAK-p-tyr397抗体免疫组织化学方法检测人肝细胞癌中FAK的活性,结果表明FAK-p-tyr397染色强度与肿瘤细胞的分化程度不相关,Grp78的表达和磷酸化FAK不相关。二、特异性下调Grp78对肝细胞癌侵袭和转移的影响Transwell实验显示Grp78-siRNA转染细胞每个低倍视野细胞数平均为83个,明显低于未转染细胞（平均210个/低倍视野）和非特异性siRNA转染细胞（平均220个/低倍视野）,统计学分析表明具有显著性差异（P＜0.05）。这表明特异性下调Grp78可以抑制肝细胞癌的侵袭。划痕法实验结果显示,24 h后Grp78-siRNA转染细胞的创口愈合较慢（53%）,而未转染细胞（92%）和非特异性siRNA转染细胞（94%）创口基本愈合。统计学分析表明具有显著差异（P＜0.05）。免疫沉淀实验结果表明,在Grp78-siRNA转染细胞中FAK的磷酸化水平明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,统计学分析具有显著差异（P＜0.05）;免疫印迹实验结果表明在Grp78-siRNA转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中,FAK的表达没有差异（P＞0.05）。以上结果表明特异性下调Grp78表达可以抑制FAK的磷酸化。GST pull-down实验结果显示在Grp78-siRNA转染细胞中,RhoA-GTP（活性形式）的水平明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞,统计学分析差异有统计学意义（P＜0.05）,这表明特异性下调Grp78可以促进RhoA的活化;免疫印迹实验结果表明,在Grp78-siRNA转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中,RhoA的表达水平没有显著差异。免疫印迹实验结果表明,在Grp78-siRNA转染细胞中N-钙黏素、波形蛋白的表达明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,而E-钙黏素的表达明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞,经统计学分析有显著性差异（P＜0.05）。三、特异性下调Grp78抑制肝细胞癌侵袭和转移的分子机制应用细胞伸展实验对Grp78-siRNA转染细胞的极性形成进行研究,结果表明在不同时间点Grp78-siRNA转染细胞的伸展明显落后于非特异性RNA转染细胞和未转染细胞（P＜0.05）。应用明胶酶谱技术和免疫印迹技术对Grp78-siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达与活性进行检测,明胶酶谱的实验结果显示Grp78-siRNA转染细胞MMP-2、MMP-9的活性明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞;免疫印迹实验结果表明Grp78-siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞。应用免疫印迹技术检测转录因子c-jun的表达及磷酸化水平,结果发现在Grp78-siRNA转染细胞中,c-jun的磷酸化水平明显降低,而c-jun的表达没有变化。[结论]1在人肝细胞癌组织中Grp78和FAK的表达与肝细胞癌的分化程度呈负相关;FAK-p-tyr397的表达与肝细胞癌的分化程度不相关;2 Grp78在肝细胞癌组织中的表达与FAK的表达呈正相关;3特异性下调Grp78可以抑制肝细胞癌的侵袭和转移,这种作用是通过抑制上皮-间叶转化和参与FAK信号转导通路的调节实现的。4特异性下调Grp78可以抑制肝癌细胞的黏着斑转换、细胞极性形成和细胞外基质的降解。5 Grp78可作为肝细胞癌治疗的一个重要靶点。
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