MicroRNA-10b靶向CDH1促进乳腺癌转移的初步研究

论文摘要

第一部分miR-10b及其下游调控基因在乳腺癌与正常乳腺组织中的表达目的：研究乳腺癌组织及正常乳腺组织中（?）niR-10b、CDH1mRNA以及上皮钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）的表达及其临床意义,分析miR-10b与CDH1mRNA以及E-cad之间的相互关系。方法：采用实时荧光定量RT-PCR （FQ-RT-PCR）方法分别检测16例正常乳腺组织、21例原发性乳腺癌组织及23例转移性乳腺癌组织中miR-10b及CDH1mRNA的表达水平；使用Western blot方法检测三种组织中E-cad蛋白的表达水平。结果：1.原发性乳腺癌组织与正常乳腺组织相比,miR-10b基因表达轻度下降约18.8%（p=0.132）；转移性乳腺癌组织与正常乳腺组织及原发性乳腺癌组织相比miR-10b基因表达明显升高分别达5.0倍及6.1倍（p=0.015）。2.原发性乳腺癌组织与正常乳腺组织相比,CDH1mRNA表达轻度升高约11.5%（p=0.270）；转移性乳腺癌组织与正正常乳腺组织及原发性乳腺癌组织相比CDH1mRNA表达显著下降分别达4.6倍及5.1倍（p=0.021）。3.原发性乳腺癌组织与正正常乳腺组织相比,E-cad表达轻度升高约20%（p=0.386）：转移性乳腺癌组织与正常乳腺组织及原发性乳腺癌组织相比E-cad表达显著下调分别达5.2倍及6.3倍（p=0.007）.4. miR-10b的表达水平与乳腺癌组织的肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、人表皮生长因子受体2 （Human epidermal growth factor receptor-2, Her-2）状态、增殖细胞核抗原Ki-67数值及临床分期呈正相关性,与雌激素受体（Estrogen receptor, ER）及孕激素受体（Progesteronereceptor, PR）状态呈负相关性（p<0.05）,而与肿瘤组织学类型及患者年龄无关（p>0.05）。5.乳腺癌中miR-10b表达与CDH1mRNA和E-cadherin蛋白表达之间存在相关性。结论：1.miR-10b在转移性乳腺癌中的表达水平显著升高,CDH1mRNA及E-cad表达水平显著降低,miR-10b与CDH1mRNA及E-cad之间存在显著负相关。2.miR-10b可能通过靶向调控CDH1mRNA的表达发挥促进乳腺癌转移的作用。3.miR-10b与乳腺癌的临床不良预后因素存在密切联系,miR-10b可以作为乳腺癌转移及预后判断的预测因子。第二部分下调miR-10b对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭能力的影响目的：分析下调miR-10b后CDH1mRNA与E-cad表达水平的变化以及对MDA-MB-231人乳腺癌细胞侵袭能力的影响,探讨miR-10b在乳腺癌转移中的作用及其通路。方法：通过脂质体介导miR-10b抑制剂（inhibitor）瞬时转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,在荧光显微镜下观察瞬时转染情况。转染后48小时,采用实时荧光定量RT-PCR （FQ-RT-PCR）方法检测MDA-MB-231人乳腺癌细胞中miR-10b及CDH1mRNA基因的表达,Western blot技术用于检测MDA-MB-231人乳腺癌细胞中上皮钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）的表达情况。设转染试剂组（Mock组）为对照。采用transwell细胞侵袭实验评价转染miR-lOb inhibitor后MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化。结果：1.脂质体转染4-6小时后即可观察到羟基荧光素基团发出的绿色荧光。2.转染inhibitor MDA-MB-231人乳腺癌细胞中miR-10b的表达显著降低（p=0.010）,CDH1mRNA的表达明显增加（p=0.009）, E-cad蛋白相对表达量显著升高（p=0.037）。3.miR-10b表达降低后转染miR-10b inhibitor组透膜细胞数目显著下降（p=0.033）。结论：1.下调miR-10b可使CDH1mRNA及E-cad蛋白表达明显升高,并显著降低MDA-MB-231人乳腺癌细胞的侵袭能力。2.本细胞功能研究初步验证了乳腺癌中存在miR-10b/CDH1mRNA促转移通路。第三部分过表达miR-10b对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭能力的影响目的：分析过表达miR-10b后CDH1mRNA与E-cad表达水平的变化以及对MDA-MB-231人乳腺癌细胞侵袭能力的影响,探讨1niR-10b在乳腺癌转移中的作用及其通路。方法：通过脂质体介导体内成熟的miR-10b模拟物（mimics）瞬时转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,在荧光显微镜下观察瞬时转染情况。转染后24及48小时,采用实时荧光定量RT-PCR （FQ-RT-PCR）方法检测MDA-MB-231人乳腺癌细胞中miR-10b及CDH1mRNA基因的表达,Western blot技术用于检测MDA-MB-231人乳腺癌细胞中上皮钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）的表达情况。设转染试剂组（Mock组）为对照。采用transwell细胞侵袭实验评价转染miR-10b mimics后MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化。结果：1.脂质体转染4-6小时后即可观察到羟基荧光素基团发出的绿色荧光。2.转染mimics MDA-MB-231人乳腺癌细胞中miR-10b的表达显著升高（p=0.001）,CDH1mRNA的表达显著下降（p=0.002）, E-cad表达量较对照组下降12.5倍（p=0.006）.3. miR-10b表达升高后转染miR-10b mimics组透膜细胞数目显著增加（p=0.018）。结论：1.过表达miR-10b可使CDH1mRNA及E-cad蛋白表达明显下降,并显著提高MDA-MB-231人乳腺癌细胞的侵袭能力。2.本细胞功能研究再次验证了乳腺癌中存在miR-10b/CDH1mRNA促转移通路。

论文目录

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• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 miR-10b及其下游调控基因在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 下调miR-10b对MDA-MB-231人乳腺癌细胞侵袭能力的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 过表达miR-10b对MDA-MB-231人乳腺癌细胞侵袭能力的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述 miRNA在乳腺癌转移中的角色及研究进展
• 参考文献
• 附录
• 致谢