视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞轴突再生与保护研究

论文摘要

目的：探索视神经损伤大鼠视神经移植后,再生的视网膜神经节细胞的基因表达变化以及激肽释放酶结合蛋白（KBP）对视网膜神经节细胞的保护作用。方法：采用对照研究的方法,将39只Listed Hooded大鼠分为①正常对照组,②神经截断组,③截断+移植组,即神经截断后外周神经移植到神经截断端实验组。采用经典的外周神经缝接模型,用免疫组化技术检测GFAP、GAP-43、NF-KB、HPS-27、视紫红质蛋白等在研究组、对照组以及实验组不同时期表达的变化。通过采用RT-PCR、Real-time PCR技术检测大鼠视网膜中12个基因的mRNA浓度的变化,使用ANOVA进行统计比较,用LSD检测进行Post-Hoc检测。另外34只SD大鼠分为①实验组,②对照组,③正常组。实验组、对照组采用直接挤压法建立不完全损伤模型,采用免疫组化技术用以观察视网膜各层结构和视网膜厚度,并对各时点视网膜神经节细胞进行计数,并用JRuler软件进行分析,行Western-blot实验检测GAP-43蛋白的表达量,以Band Scan 5.0图像分析软件进行分析,旨在明确KBP是否有视网膜神经节细胞保护和促进其轴突再生作用。结果：①视网膜切片显示了神经截断组GFAP在5和14天有明显的表达上调；与截断组的视网膜相比较,在移植后5,14和21天,截断+移植组的GFAP表达下调；而对照组GFAP在GCL染色呈阴性反应。在5天时,坐骨神经段移植后GAP-43在GCL出现明显表达上调,并且GAP-43免疫反应性在移植后的14天有强烈的上调,但在21天后,只有少量的GAP-43在GCL表达。在再生的视网膜中NF-κb迁移到核仁样结构内。HPS-27蛋白质似乎在视神经切断后的5天在RGCs中重新分布。在视神经截断后的14天,此时视网膜RGCs已耗竭,在神经节细胞层中几乎检测不到HSP-27。在截断+移植组的视网膜中,HSP-27在术后持续表达21天。②RT-PCR检测结果中,这些基因未发现明显变化。③Real-time PCR结果,5天后,视网膜中的GFAP表达在截断组和截断+移植组与对照组相比有显著的增加（P<0.01）。然而,GFAP表达在任一时点的截断+移植组和截断组没有显著差异。在5天后,截断+移植组比对照组的视网膜中GAP-43的表达有显著增加（146±11%,P<0.05）,然而在截断组中没有观察到同样的增加（108±31%,P<0.05）。在其后的时点,GAP-43的表达在两个实验组都比对照组有显著降低（P<0.05）。截断+移植组大鼠的降低程度的显著性较小,与第5天相比,差异没有统计学意义（14天：64±12% vs.39±4%；21天：46±6% vs.42±1%,）。所有时点,两实验组比对照组视网膜Thy-1的表达都有显著的减少（P<0.01）。Thy-1的表达在截断+移植和截断组大鼠中没有显著差异。截断+移植组与截断组视网膜的ET-1相比,随时间而出现明显的表达上调（14天：108±24% vs.148±21%）。但是所有时点两组组别之间的视网膜ET-1表达的差异没有统计学意义。ETB在各组之间所有时间点,视网膜中的ETB受体的表达没有统计学差异。④SD大鼠视神经不完全损伤后,通过HE染色,我们观察了视网膜各层结构变化,通过双盲法计数RGCs,和视网膜厚度测量,经统计学分析,组间差异具有统计学意义。⑤对神经再生的标记蛋白GAP-43进行Western-blot分析,经统计学处理,组间GAP-43表达差异具有统计学意义。结论：（1）正常大鼠GFAP分布于视网膜神经节细胞层（GCL）和神经纤维层（NFL）的星形胶质细胞中；神经截断大鼠视网膜GFAP呈高表达,提示Muller细胞和星形胶质细胞可能受到抑制；神经截断后外周神经移植大鼠视网膜GFAP表达水平降低,提示神经截断的部分视网膜神经节细胞（RGCs）能够产生再生反应。（2）正常大鼠和神经截断大鼠视网膜无GAP-43表达,而神经截断后外周神经移植大鼠视网膜GAP-43表达上调,提示GAP-43表达可能与神经截断的RGCs再生有关。（3）正常大鼠视网膜中NF-κB定位于细胞质内,神经截断后外周神经移植大鼠视网膜NF-κB易位到细胞核,提示NF-κB活化参与了神经截断的RGCs再生过程。（4）正常大鼠视网膜中RGCs中有HSP-27表达,神经截断大鼠视网膜HSP-27无表达,神经截断后外周神经移植大鼠视网膜HSP27持续表达,提示作为应激蛋白,HSP-27可能对神经截断的RGCs具有保护作用。（5）正常大鼠、神经截断大鼠和神经截断后外周神经移植大鼠视网膜视紫红质的表达无明显变化,提示紫红质与神经截断的RGCs再生无明显关系。（6）神经截断大鼠和神经截断后外周神经移植大鼠视网膜GFAP mRNA表达增加,提示作为神经营养因子,GFAP增加可为截断的神经细胞提供一个适宜再生的微环境,可能在神经截断的RGCs的再生中发挥作用。（7）神经截断后外周神经移植大鼠视网膜GAP-43 mRNA的表达增加,提示GAP-43作为神经元生长相关蛋白,可能参与神经截断的RGCs的再生。（8）神经截断大鼠和神经截断后外周神经移植大鼠视网膜Thy-1 mRNA表达降低,可能作为评价神经截断的RGCs再生能力的一个参考指标。（9）神经截断后外周神经移植大鼠视网膜ET-1 mRNA表达明显增加,提示作为神经因子,能够维持神经和血管完整性,可能与促进神经截断的RGCs再生有关。（10）正常大鼠、神经截断大鼠和神经截断后外周神经移植大鼠视网膜ETB mRNA表达无明显变化,提示ETB与神经截断的RGCs再生无明显关系。（11）视神经不完全损伤后玻璃体腔注入PBS溶液,大鼠视网膜视神经节细胞核染色深浅不一,核碎裂,有的细胞核呈空泡状改变,各层次间结构尚存,视神经节细胞数量减少明显,细胞极性极度紊乱,内丛状层变薄,甚至消失,提示PBS对视神经损伤无保护作用。（12）视神经不完全损伤后玻璃体腔注入KBP蛋白溶液,大鼠视网膜各层次结构尚清晰,视神经节细胞细胞呈单层排列,细胞核染色均匀,视神经节细胞数量随时间的增加而减少,出现轻度的内丛状层变薄,细胞极性轻度紊乱,提示KBP蛋白对视神经损伤具有一定的保护作用。（13）视神经不完全损伤后玻璃体腔注入KBP蛋白溶液,大鼠视网膜视神经节细胞细胞平均数量、视网膜平均厚度和视神经GAP-43蛋白表达均高于视神经不完全损伤后玻璃体腔注入PBS溶液大鼠,提示提示KBP蛋白对视神经损伤具有一定的保护作用。（14）玻璃体腔注入KBP蛋白溶液可为临床治疗视神经损伤提供科学的理论和实验依据。

论文目录

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• 英文缩略词一览表
• 引言
• 1. 研究背景
• 2. 星形胶质细胞在轴突再生中的作用
• 2.1. 神经胶质增生和损伤修复
• 2.2. 胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）
• 3. 神经元生长相关蛋白-43（GAP-43）和神经元再生
• 3.1. 轴突生长发育初期的必要因素—GAP-43
• 3.2. 神经生长相关蛋白-43过度表达与神经元再生相关联
• 4. 作为视网膜神经节细胞标记物的胸腺特异性抗原（Thy-1）
• 5. 内皮素-1（ET-1）
• 5.1. 在中枢神经系统调节星形胶质细胞的功能
• 5.2. 视网膜神经元和神经胶质内内皮素-1的作用
• 6. 核因子-κB（NF-κB）
• 7. 热休克蛋白
• 8. 激肽释放酶结合蛋白（KBP）
• 9. 损伤模型建立和方法运用
• 9.1. 视神经截断和周围神经移植的动物模型
• 9.2. 实时定量PCR
• 9.3. 蛋白质印记
• 第一部分 视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞轴突再生相关基因研究
• 1. 材料和方法
• 1.1. 外科技术
• 1.2. 免疫组化
• 1.3. 分子生物学研究
• 1.4. 统计学方法
• 2. 结果
• 2.1. 免疫组织化学
• 2.2. 半定量RT-PCR
• 2.3. 实时定量PCR
• 3. 讨论
• 3.1. GFAP表达的上调
• 3.2. 再生视网膜GAP-43的上调
• 3.3. NF-κB可能在再生RGCs的早期反应中起到神经保护作用
• 3.4. HSP27
• 3.5. Thy-1和ET-1
• 4. 结论
• 第二部分 激肽释放酶结合蛋白对视神经不完全损伤后大鼠视网膜神经节细胞保护作用的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1. SD大鼠视神经不完全损伤模型的建立及玻璃体腔注药
• 1.2. 实验组与对照组视网膜组织结构的观察和RGCs存活数的对比
• 1.3. 实验组与对照组神经生长相关蛋白-43表达变化
• 1.4. 统计学方法
• 2. 结果
• 2.1. 大鼠视神经不完全损伤模型建立
• 2.2. 大鼠视网膜组织形态学结构变化
• 2.3. 大鼠视网膜神经节细胞数量变化
• 2.4. 大鼠视网膜厚度变化
• 2.5. 大鼠视神经GAP-43蛋白表达
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 文章发表情况
• 致谢