论文摘要
目的腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma）又称圆柱瘤（cylindroma），由Biliroth首次报道，多数人认为肿瘤来自涎腺导管，也可能来自口腔粘膜的基底细胞。腺样囊性癌占涎腺肿瘤的5％～10％，在涎腺恶性肿瘤中占24％，其中在颌下腺及舌下腺中是居首位的恶性肿瘤，最多见的年龄是40～60岁。其主要的病理学特点为嗜神经侵犯及易于远处转移，目前对腺样囊性癌多主张采用手术联合放化疗的综合治疗为主，其五年生存率一般在60％左右，其10年、15年、20年生存率分别为30～39％、24～26％、12.5～21％，其疗效仍然不能令人满意。因此，探讨新的治疗方法具有极其重要的意义。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速，主要的方法有自杀基因、免疫基因、多药耐药基因以及抗血管生成基因等。其中自杀基因被认为是最有前景的基因治疗方法之一。自杀基因治疗（suicide gene therapy）又称酶／药物前体疗法（enzyme-prodrug therapy，EPT），是利用转基因技术将哺乳动物中所不含有的自杀基因转入到哺乳动物肿瘤细胞中，该基因表达的产物可将无毒性的药物前体转化为毒性药物，从而选择性的杀伤肿瘤细胞，常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（E．coli-cytosine deaminase，CD）基因，前者催化无毒性抗病毒核苷类似物如丙氧鸟苷（GCV）、无环鸟苷（ACV）等成为单磷酸核苷衍生物（dTMP），然后在内源性细胞激酶作用下转化为有明显毒性的三磷酸核苷（dTTP），作为DNA合成链的终止剂，干扰细胞DNA的合成；后者编码的胞嘧啶脱氨酶可催化5-氟胞嘧啶（5-FC）脱氨为5-氟尿嘧啶（5-FU），然后代谢为有毒性的5-氟尿嘧啶-5′三磷酸（5-FUTP）和5-氟-2′脱氧尿嘧啶-5′三磷酸（5-FdUTP），5-FUTP通过与UTP竞争性结合而抑制mRNA和tRNA的合成，5-FdUTP则作用于胸苷合成酶（TS），导致TMP的衰竭而阻止DNA的合成，最终诱导肿瘤细胞的凋亡。在以往的研究中单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／无环鸟苷系统（HSV—tk／GCV）是一种很常见的自杀基因治疗系统，由于前药GCV不容易通过血脑屏障而在CNS应用受到一定的限制。而CD基因是另外一种自杀基因，哺乳动物细胞不含该酶，细菌和真菌能产生该酶，可将5—FC脱氨为5—FU。临床上5—FC和5-FU的药代动力学非常清楚，与5-FU不同，5—FC治疗剂量对人体毒副作用不大，口服容易通过血脑屏障，这是CD／5-FC系统在治疗口腔颌面部肿瘤实验研究中，比HSV—tk／GCV系统应用广泛的原因。本实验正是基于此，旨在构建真核表达质粒pIRES-CD，并将其转染ACC-2细胞后，应用前体药物5-FC治疗，初步探讨CD／5-FC系统对ACC-2细胞的杀伤作用及旁观者效应，以寻求有效的自杀基因治疗方法。方法首先根据CD的DNA序列设计、合成引物，并将扩增后产物插入克隆载体pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-CD，进行PCR筛选及重组质粒的酶切分析，然后将重组质粒pMD18-T-CD插入经相应酶切的真核表达载体pIRES，获得重组表达质粒pIRES-CD，进行菌落PCR初步鉴定及重组质粒的酶切分析。然后以电穿孔方法将重组表达质粒pIRES-CD转染ACC-2细胞，新霉素（Geneticin G418）筛选后获得稳定表达的ACC-2／CD细胞，并经RT-PCR鉴定CD基因是否整合到ACC-2细胞DNA链中并转录表达。加入不同浓度的5-FC对ACC-2／CD细胞和ACC-2细胞进行处理，并以未加药组作对照，MTT法检测药物的杀伤效果及其对ACC-2细胞体外生长增殖的影响，计算细胞生长抑制率（GIR）及半数抑制浓度(IC50)；并观察ACC-2／CD与ACC-2细胞在不同混育比例下应用不同浓度5-FC对腺样囊性癌的杀伤作用及旁观者效应。结果成功克隆了大肠杆菌CD基因，并进行了DNA序列分析，和基因库报道的基因序列基本一致，然后将克隆的CD基因插入到克隆载体pMD18-T，后将重组的克隆载体pMD18-T-CD和pIRES分别经双酶切，成功构建了重组表达质粒pIRES-CD，并分别进行了菌落分析和酶切鉴定。将重组质粒pIRES-CD成功转入ACC-2细胞，经G418筛选后获得稳定表达CD基因的ACC-2／CD细胞，RT-PCR显示长度为228bp的阳性条带，证实目的基因已整合到ACC-2细胞染色体DNA链中并转录表达，目的基因转染对ACC-2细胞的形态及生长特性影响不大。5-FC浓度为20ug／ml时开始出现对ACC-2／CD-TK细胞生长的抑制；而在细胞浓度为320ug／ml时几乎未见该细胞生长，根据量效关系计算出半数抑制浓度(IC50)为55.42ug／ml，而未转染ACC-2细胞的生长仅在5-FC浓度达到160ug／ml时才开始出现受到抑制，而且作用轻微，其IC50为265.56ug／ml，统计学分析二者差异有显著意义（P＜0.01）。不同混育比例的细胞杀伤作用结果显示，转染细胞对5-FC的敏感性与混育比例的大小有关。随着ACC-2／CD细胞比例的增大，其杀伤作用越明显；当混合细胞中转染细胞比例为5％时即出现旁观者效应，当混育比例超过50％后各组的细胞杀伤效果已无显著差异（P＞0.05）结论1．成功克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了克隆载体pMD18-T-CD，且对CD基因进行序列分析显示，克隆的序列和文献报道的基本一致。2．在克隆载体pMD18-T-CD的基础上成功构建了重组真核表达载体pIRES-CD，并进行了菌落分析和酶切鉴定。3．应用电穿孔的方法成功将pIRES-CD转染ACC-2细胞，并进行RT-PCR鉴定，获得了预期的228bp的片段。4．应用5-FC对ACC-2／CD细胞具有剂量依赖性生长抑制作用，且随着剂量的增加，对细胞的杀伤作用增强；且5-FC／CD体系可引起较明显的旁观者效应。