衰老及相关疾病中线粒体损伤与保护机制研究

论文摘要

在阐述衰老现象的多种理论中,自由基衰老理论近年来受到广泛重视,得到众多实验证据支持。自由基衰老理论认为,在衰老及相关疾病（如帕金森病（Parkinson’s disease,PD）,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD））中,自由基对细胞内生物大分子（核酸、脂类、蛋白等）产生氧化损伤,损伤随年龄累积从而损害细胞功能,导致细胞功能衰退或丧失,最终造成机体衰老及老年性疾病。自由基中最重要的一类活性分子是含氧自由基,即活性氧（reactive oxygen species,ROS）,线粒体（特别是损伤线粒体）是细胞内产生ROS的主要细胞器,同时线粒体自身富含的多种酶、结构蛋白、膜脂质及核酸等也是ROS直接攻击的目标,受损线粒体ROS产生增加,造成线粒体内氧化损伤的恶性循环。对于衰老及相关疾病中,如何简便定量线粒体基因中的异质性/点突变:在ROS（如活性较强的羟自由基,·OH）作用下线粒体呼吸功能及线粒体中相关抗氧化系统如何变化;ROS引发线粒体内膜脂质过氧化后,脂质过氧化产物（MDA）累积是否进一步损伤线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶;依据线粒体营养素假说,在衰老及相关疾病（PD）所致的线粒体功能损伤中,如何靶向性干预和纠正线粒体氧化损伤;线粒体营养素（如硫辛酸）在衰老及PD动物模型中,如何缓解相关症状,其可能的生化机制如何。以上内容还缺乏足够的实验研究。 针对以上问题,本研究以线粒体为研究重点,从线粒体核酸、酶学、特征蛋白表达等方面在体外及活体模型作了以下几方面探索: 一.改良PCR-RFLP法测定异质性线粒体基因相对含量 发生线粒体病变的细胞或受到活性氧攻击的线粒体中往往存在线粒体基因异质性现象,测定异质性线粒体基因的相对含量对于了解线粒体基因功能及基因诊断具有一定的意义。我们在研究ECV304细胞线粒体基因D-LOOP区过程中,通过克隆测序,发现在ECV304细胞线粒体基因513碱基存在A/G异质性,用传统PCR-RFLP、3′端特异引物法无法测定异质性基因的相对含量。通过对传统PCR-RFLP法的改进,依据ECV304细胞中线粒体基因（D-LOOP区）异质性位点,采用两轮PCR法,第一轮PCR胶回收产物为模板,设计半巢式引物作第二轮PCR,并在第二轮PCR中引入限制性内切酶位点,酶切产物行琼脂糖电泳,测定异质性线粒体基因的相对含量。发现ECV304细胞中存在513A/G异质性,二者比例约为1/3。改良PCR-RFLP法测定异质性线粒体基因相对含量较为简单可靠,适用于异质性线粒体基因的研究。

论文目录

• 独创性声明
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• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 相关文献
• 第一章 氧化应激对线粒体功能影响的体外研究
• 第一部分 改良PCR-RFLP法测定异质性线粒体基因的相对含量
• 1 试验试剂和材料
• 2 方法和结果
• 3 讨论
• 第二部分 羟自由基对大鼠肝线粒体复合物I的损伤及黄素单核苷酸的保护作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 丙二醛对大鼠肝线粒体呼吸功能及有关脱氢酶活性影响
• 1 方法与材料
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 第二章 线粒体营养素对线粒体氧化损伤的体内保护机制研究
• 第一部分 α-硫辛酸改善D-半乳糖致早衰小鼠脑和肝线粒体 琥珀酸呼吸链的功能
• 1 方法与材料
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 α-硫辛酸对α-synuclein转基因帕金森病果蝇的保护作用
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 课题综述
• 致谢
• 附录