下调c-fos基因影响小鼠胚胎成纤维细胞内MMPs的表达

论文摘要

背景钙网蛋白（calreticulin, CRT）是内质网中重要的Ca2+结合分子伴侣，具有调控蛋白合成和细胞内Ca2+稳态等功能，是一种近年来备受瞩目的影响心脏发育的重要调节蛋白。钙网蛋白基因缺失（crt-/-）小鼠存在心脏发育缺陷，表现为心脏发育不全，心室壁变薄，甚至胎死宫内，原因可能与细胞外基质含量变化有关；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一组能降解细胞外基质与胶原的锌依赖蛋白酶家族，在调节心脏细胞外基质与胶原方面具有重要作用。本课题组前期研究发现与野生型（wide type, wt）小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）比较，crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞内MMP-2活性增高，而MMP-9的活性明显减弱，这可能是crt-/-小鼠心脏发育不全的原因之一，但机制未明；且前期的基因芯片和Western Blot实验发现，两株细胞间c-fos表达存在显著性差异，因此我们推测c-fos可能参与了两株细胞间MMPs的活性调节。目的本实验旨在通过多种实验手段，探讨c-fos在调节wt与crt-/-小鼠心脏胚胎成纤维细胞内MMP-2/9活性变化中的作用，以进一步揭示crt-/-小鼠心脏发育缺陷的原因。方法体外培养wt和crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞，提取RNA，利用RT-PCR法检测两株细胞内c-fos的表达情况，结合蛋白表达情况（本课题组前期实验结果），确定干扰细胞株。siRNA干扰某细胞株内c-fos基因的表达后，倒置显微镜下观察转染后细胞形态并结合RT-PCR法确定干扰效率，同时用RT-PCR法检测转染后相关基因的表达变化情况，并用Zymography法检测转染后MMP-2/9的活性变化。实验所得数据用SPSS17.0分析。结果1.与wt相比，crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞中c-fos的mRNA表达明显下降（P<0.05），与核蛋白表达（本课题组前期实验结果）趋势相一致；MFH-1的mRNA表达明显上升（P<0.05）；HEB mRNA表达基本不变，两者间无显著性差异；2. siRNA转染wt小鼠胚胎成纤维细胞抑制c-fos基因后，干扰组内c-fos mRNA表达下降，伴随着MMP-9的mRNA表达及活性下降（P<0.05）；无论在干扰组还是对照组内（包括转染试剂对照组）MMP-2的活性均明显升高。针对c-fos的siRNA转染wt小鼠胚胎成纤维细胞后，wt小鼠胚胎成纤维细胞内MMP-2/9活性变化趋势与crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞表现相似。结论1. c-fos在小鼠心脏胚胎成纤维细胞中MMP-9的活性调节方面具有重要作用；2. crt-/-小鼠心脏胚胎成纤维细胞可能通过下调c-fos表达，使MMP-9活性降低，导致细胞外基质含量改变，是钙网蛋白基因缺陷小鼠心脏发育缺陷的原因之一。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词对照表
• 第一章 前言
• 1.1 研究背景
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验细胞
• 2.1.2 实验药品和实验试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 RT-PCR 实验
• 2.2.3 siRNA 实验
• 2.2.4 Zymography 实验
• 2.3 统计方法
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述：钙网蛋白基因缺陷致心脏发育缺陷的分子机制
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 个人简介