论文摘要
植物液泡型Na+/H+逆向运输体利用液泡膜H+-ATPase（V-ATPase）和液泡膜H+-PPase（V- PPase）产生的跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡内积累。这不仅能够降低胞质内的Na+以维持胞质正常的K+/Na+比值,还可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂。在拟南芥、西红柿、水稻、玉米、小麦中过量表达液泡膜上的Na+/H+反向运输体AtNHX1,可以使转基因植株在较高浓度盐环境中生长,说明液泡型Na+/H+逆向运转体在植物的耐盐性中有重要作用。濒危灭绝植物盐桦（Betula halophila）是一种新疆特有的,抗盐能力非常强的盐生植物,是盐碱地绿化和造林的重要树种。在生物学分类上盐桦属于被子植物桦木科（Betulaceae）,是国家重点保护Ⅱ级野生植物。仅分布在阿勒泰地区—局部潮湿盐碱滩,是西北盐碱地造林非常看好的树种,从分子和生理水平研究它的耐盐机理在利用盐桦的基因资源来改良作物性状,培育耐盐碱的树种方面具有重要的意义。因此本研究利用组织培养获得的盐桦苗为试材,对盐桦液泡型反向运输体进行基因克隆、序列比较、表达分析和功能鉴定,并对其耐盐的生理生化指标进行了初步研究,主要结果如下:1.利用同源序列设计多条引物,通过RT-PCR的方法从盐桦中克隆到Na+/H+反向运输体基因的核心片段,再通过5’-RACE和3’-RACE技术分别克隆获得Na+/H+反向运输体基因的5’端序列和3’端序列,根据重叠区,拼接后设计特异引物扩增获得Na+/H+反向运输体基因cDNA,全长2165bp,其中ORF长1623bp,编码一个540个氨基酸的多肽,5’UTR区和3’UTR区的长度分别为205bp和337bp。2.基因CDS及编码蛋白质同源序列比较发现,其中与葡萄（Vitis vinifera） NHX1基因同源性达到75%,与水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、胡杨（Populus euphratica）以及毛白杨（Populus tomentosa）的NHX1基因同源性分别达到68%、65%、72%和72%,说明BhNHX1可能是液泡型Na+/H+逆向运转体。胡杨、毛白杨和盐桦均为木本植物,所以同源性较高,而水稻和拟南芥为非木本植物,所以同源性较低;葡萄幼苗在形态上与盐桦苗非常相象,两者NHX基因和蛋白序列同源性都较高,是否暗示两者亲缘关系较近,还有待深入研究。跨膜结构分析表明,BhNHX1氨基端有11个保守的跨膜结构域（TM）,而羧基端是亲水的。TM3有非常保守的氨氯吡嗪咪（Amiloride）的结合域(85LFFIYLLPPI94),可能是Amiloride与Na+的竞争结合位点。AtNHX1的TM5,TM6和TM3并没有完全跨过液泡膜,这几个跨膜结构域与Na+结合,可能是TM3与TM5和TM6聚合成离子通道,TM3位于通道临近细胞质的位置,TM5和TM6位于临近液泡的一侧,介导Na+内流向液泡,BhNHX1可能也具有AtNHX1的这种结构。3.半定量RT-PCR表达分析表明BhNHX1受盐胁迫诱导,CaM在各种处理下表达量都较高,说明CaM可能是调节植物基因表达的一个通用信号因子。BhNHX1也能被干旱、冷和ABA诱导,说明BhNHX1对盐胁迫的非专一性。同时暗示着BhNHX1的启动子可能含有ABRE和DRE/ CRT元件,能被多种胁迫所诱导。4.盐桦在盐胁迫下,植物叶片中脯氨酸含量是随盐浓度的增加而递增的,相对含水量是逐渐降低的;随着盐浓度的提高,导致了植物体内K+/Na+比值的降低,打破了盐桦植株体内正常的离子平衡;CAT活性在0-200mM NaCl是逐渐升高的,此时丙二醛含量变化不大,然而CAT活性在300mM时显著降低,MDA此时突然升高,说明在300mM NaCl胁迫时盐桦苗细胞中的CAT是无法起保护作用,细胞膜遭受了较大的损伤。随着盐浓度的提高,盐桦正常的生理生化代谢被扰乱,这可能造成植株在较高盐浓度胁迫下死亡的原因。5.在盐桦茎叶中发现可能是草酸钙的晶体,它在盐桦中具体的形成条件及生物学功能还有待进一步研究。6.转BhNHX基因烟草和野生型烟草进行了基因组PCR和RT-PCR的分析,初步表明BhNHX1可能整合到烟草基因组中。BhNHX1能在转基因烟草中过量表达,400 mM NaCl处理下的转基因烟草比野生型烟草MDA含量低,差异是显著的。