毛竹微卫星标记的开发及其在竹类植物基因组分析中的应用

论文摘要

毛竹（Phyllostachys pubescens）是禾本科（Gramineae）竹亚科（Bambusoideae）刚竹属（Phyllostachys）植物。是我国竹类资源中最主要的竹种之一,生长快、分布广、利用多、具有重要的经济价值和生态价值。竹亚科植物染色体数目较多而且不稳定,普遍存在多倍性、非整倍性、混倍性和染色体结构变异等现象,染色体结构和基因组特性等方面的研究很少,研究迫切需要一种快速、高效的方法和技术。SSR（Simple Sequence Repeat）标记作为以PCR技术和测序技术为基础的分子标记,是构建高密度分子遗传图谱、物种分类与进化分析、染色体结构分析、品种遗传多样性研究、品种保护与纯度鉴定、研究杂种优势机理及预测的有效工具,被认为是当前种内遗传变异研究中分辨率最高、揭示力最强的分子标记。本研究查阅了大量相关文献,发现竹类植物中的SSR标记很少,只有Nayak和Rout等开发的印度刺竹（Bambusa arundinacea）的6个SSR位点,为了能在竹类植物中开发大量的可以广泛运用的SSR标记,我们选择了重要竹种毛竹为开发对象,尝试在毛竹中开发一批在竹类植物中具有高通用性标记,那样将为其他竹种SSR标记的开发降低成本,为竹类植物相关研究所用。随着网络数据库数据量的日益增加,利用生物信息学的方法来开发SSR引物已渐成熟。本研究通过搜索GenBank毛竹系列,自行开发了19对SSR引物。用这些引物研究了毛竹11个变型（栽培类型）的遗传多样性发现,毛竹和其变型（栽培类型）之间的遗传多样性很低,从电泳图上看所有的19对SSR标记基本上没有什么多态性条带,这与栽培过程中观察到的不同类型之间可以相互转换的现象一致,暗示其变型的产生可能是其他机制造成的。另外,利用刚竹属中7种代表性的竹种对这些SSR引物的通用性进行了分析,发现有10个毛竹SSR标记PBM014, PBM016, PBM018, PBM020, PBM022, PBM025, PBM023, PBM027, PBM028和PBM004在6个刚竹属其他竹种具有很好的通用性;PBM002和PBM007的通用性最低;PBM026虽然有PCR产物,但是不含有SSR位点;其他SSR标记在其他竹种中也有部分不能通用或有扩增产物但是没有SSR位点的现象。总的来说,我们开发的毛竹SSR标记在同属中的通用性为73.7%。由于GenBank中毛竹序列有限,为了得到更多的SSR位点,我们结合传统的构建微卫星富集文库的策略,自行设计了一套新的SSR引物开发策略。使用常用的EcoRⅠ或MseⅠ对毛竹基因组进行酶切,两端分别相对应接上AFLP接头,随后用改进了的少了第一个选择性碱基的AFLP预扩增引物放大酶切片段数量,再用探针（GA）10,（GACA）6,（CA）10,CAA)10,（GAA）10,（CAT）10和（GAT）10杂交和磁珠富集,用改进的引物经PCR后使单链变成双链。片段产物连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌,测序。得到的含有SSR位点的序列设计引物,对毛竹基因组DNA进行扩增后,测序预计大小的目的片段,最终我们构建（GA）10和（GACA）6两个探针的文库,初步得到48个毛竹SSR标记。为了进一步研究竹类植物染色体特点,本研究还利用荧光原位杂交（FISH,fluorescence in situ hybridization）技术,以拟南芥端粒重复序列（CCCTAAA）n及寡核苷酸（AG）12、（AT）11、（AAG）5和（GACA）4等作探针,检测这些微卫星序列在毛竹染色体上的分布。掌握了竹类植物染色体上SSR序列的FISH技术,初步了解了拟南芥端粒重复序列（CCCTAAA）n和毛竹染色体上的分布情况,为接下来探索微卫星序列在竹类植物的染色体上的变化,进而推断竹类植物染色体的结构和进化过程开辟了新的研究思路。此外,利用在刚竹属多个竹种中通用性较好的毛竹SSR标记对部分丛生竹以外竹种的杂交后代进行了幼苗期的鉴定,研究杂交竹种中各亲本的遗传物质交流程度。通过实验发现,PBM014,PBM018和PBM025在亲本的SSR位点上等位基因多态性丰富,在亲本和杂交子代上对应位点上的等位基因稳定遗传,表明确实有遗传物质的交流,直接证实了所待测疑似杂种的真实性,为杂交竹种的后期研究工作奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 竹类植物现有分子标记的类型和应用
• 1.1 RFLP 的应用
• 1.2 RAPD 的应用
• 1.3 AFLP 的应用
• 1.4 ITS 的应用
• 1.5 SSR 的应用
• 2 各类型分子标记的特征比较
• 3 常用的获得SSR 标记的方法
• 3.1 构建和筛选DNA 文库
• 3.1.1 构建全基因组文库
• 3.1.2 构建微卫星富集文库
• 3.2 利用生物信息学方法搜索数据库
• 3.3 利用比较遗传学从近缘物种获得
• 4 SSR 标记在植物基因组分析上的应用
• 4.1 SSR 在植物染色体上的定位
• 4.1.1 FISH 技术的原理和应用
• 4.1.2 利用FISH 技术在植物染色体上定位SSR
• 4.2 SSR 标记在杂种植物亲本和子代基因组分析上的应用
• 5 本论文的主要研究内容和研究策略
• 第二章 毛竹SSR 的开发
• 1 生物信息学方法
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 毛竹DNA 的提取
• 1.1.2 毛竹序列的获得
• 1.1.3 含有SSR 位点的毛竹序列的筛选
• 1.1.4 引物的设计和验证
• 1.1.5 测序
• 1.2 结果与分析
• 2 构建微卫星富集文库方法
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 DNA 提取和其他试剂
• 2.1.2 微卫星富集文库的建立
• 2.1.3 测序
• 2.1.4 引物的设计和验证
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 毛竹基因组DNA 的酶切
• 2.2.2 接头连接
• 2.2.3 富集后检测
• 2.2.4 文库的构建
• 2.2.5 对构建的文库进行点杂交
• 2.2.6 引物的设计和验证
• 2.3 讨论
• 第三章 SSR 标记在竹类植物基因组分析上的应用
• 1 研究各SSR 标记在毛竹不同变种基因组中的多态性情况
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果及分析
• 2 各SSR 标记在刚竹属代表种基因组中的多态性情况
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果及分析
• 3 SSR 在毛竹染色体上的物理定位分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毛竹根尖的获得
• 3.1.2 根尖细胞（RTC）染色体制片
• 3.1.3 制片预处理
• 3.1.4 探针标记
• 3.1.5 杂交
• 3.1.6 杂交后洗片
• 3.1.7 加抗体
• 3.1.8 用DAPI 处理
• 3.1.9 镜检
• 3.2 结果与讨论
• 4 各SSR 标记在杂交竹种子代个体中的多态性情况
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 毛竹SSR 标记在杂种鉴定中的运用
• 4.2.2 杂交竹种的SSR 分子标记分析
• 4.3 讨论
• 第四章 全文小结
• 参考文献
• 硕士期间参与科研项目及发表的文章
• 致谢