刘佳1冯玉光2（通讯作者）张小茜2仲华2
(1潍坊医学院山东潍坊261031）
（2潍坊医学院附属医院消化内科山东潍坊261031)
【摘要】目的研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布对低氧模拟剂氯化钴诱导的胃癌细胞株SGC-7901OCT-4表达的影响。方法以胎牛血清加RPMI1640培养基培养细胞作正常对照，分别应用150μmol/L氯化钴联合0μmol/L、25μmol/L、75μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901细胞48h,应用RT-PCR技术检测细胞中OCT-4mRNA表达。结果与正常对照组比较,150μmol/L氯化钴刺激48h,可显著提高细胞OCT-4mRNA的表达(P<0.05),塞来昔布和氯化钴联合作用48h,细胞OCT-4mRNA表达降低(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论COX-2抑制剂塞来昔布可抑制氯化钴诱导的OCT-4表达,这可能是其抗肿瘤的机制之一。
【关键词】胃癌塞来昔布低氧OCT-4
【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）06-0041-02
EffectofCelecoxibontheexpressionofOCT-4inhumanSGC-7901cellsinducedbycobaltchloride
【Abstract】Ami:TostudytheeffectsofCOX-2-selectedinhibitorCelecoxibontheexpressionofOCT-4inhumangastriccancercelllineSGC-7901cellsinducedbyhypoxiamimiccobaltchloride.Methods:SGC-7901cellsstimulatedbycobaltchloride(150μmol/L)orcombinedwith0μmol/L,25μmol/L,and75μmol/LCelecoxibfor48h,weresubjectedtodeterminetheexpressionofOCT-4mRNAusingRT-PCR.Results:ComparedwiththeSGC-7901cellswithoutanyinduction,150μmol/LcobaltchloridestimulatedtheexpressionofOCT-4mRNAandinSGC-7901cells(P<0.05),andCelecoxibpreventedthecobaltchloride-simulatedup-regulationofOCT-4mRNAinadose-dependentmanner(P<0.05).Conclusion:CelecoxibcouldinhibitthehighexpressionofOCT-4mRNAinSGC-7901cellsinducedbyhypoxia,whichmaybeoneofitsantiangiogenesismechanisms.
【Keywords】GastriccancerCelecoxibHypoxiaOCT-4
肿瘤低氧是许多实体肿瘤的典型特征,研究表明,低氧状态能促进肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期及增殖、增加对放化疗及手术的抵抗性,并且促进肿瘤的侵袭和远处转移[1]。近年来发展起来的肿瘤干细胞理论认为肿瘤是一种干细胞疾病[2]。OCT-4是POU家族的成员,与细胞的生长及分化有关,通常认为其表达与胚性细胞的多能性有关，是细胞干性状态的标志[3]。研究显示,COX-2的表达是所有恶性肿瘤的典型特征,它的表达随着肿瘤生长及转移的不同阶段会有不同变化。选择性的COX-2抑制剂塞来昔布可以减轻胃癌发生风险,预防癌前病变[4]。但COX-2抗肿瘤机制尚不明确,本研究推测COX-2抑制剂可能通过抑制低氧诱导的OCT-4表达来发挥抗肿瘤作用。为此,作者观察了选择性COX-2抑制剂塞来昔布对低氧模拟剂氯化钴诱导的胃癌细胞株BGC-7901OCT-4表达的影响。
1.材料与方法
1.1材料：人胃癌细胞株SGC-7901购自山东省医学科学院；塞来昔布(大连美仑生物制药有限公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司产品；胰酶细胞消化液、青链霉素混合液购自碧云天生物技术有限公司；氯化钴（CoCl2）、DEPC、DMSO购于美国Sigma公司；Trizol试剂、DNA多聚酶链式反应试剂盒、MmLV逆转录试剂盒、DNAMarker购自上海生工生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组:人胃癌细胞株SGC7901接种于含100mL/L胎牛血清、青霉素、链霉素各l×105U/L的RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱内常规传代培养。细胞生长至60%-70%融合后,以含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养基(空白培养基)继续培养24后,分4组培养。①正常对照组:空白培养基；②Co组:150μmol/LCo加空白培养基；③Co+Cel组1（培养基中加入150μmol/LCoCl2+25μmol/LCel）；④Co+Cel组2（培养基加入150μmol/LCoCl2+75μmol/Lcel）,继续培养48h。
1.2.2总RNA的提取和RT-PCR:收集细胞,冰冷PBS洗涤2次,按照Trizol说明书提取细胞总的RNA,按照RT-PCR逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA第一链和OCT-4的扩增,以GAPDH作为内参照。Premier5.0软件设计引物,GAPDH：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游5′-CCAGTTGTAGGCTCATCCA-3′,扩增片断452bp；OCT-4产物397bp）:上游引物：5′-TATACACAGGCCGATGTGG-3′,下游引物：5′-GTGCATAGTCGCTGCTTGA-3′。PCR引物反应条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30ｓ,35个循环；72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果,应用ImageＪ图像分析软件计算各条带吸光值,目的条带吸光值分别与相应GAPDH吸光值相比,即为其相对表达量。
1.3统计学方法：数据用x-±s表示,组间比较用t检验及单因素方差分析,用统计软件SPSS18.0分析,P＜0.05为有统计学意义。
2.结果
胃癌SGC-7901细胞OCT-4mRNA的表达RT-PCR电泳结果见表1,显示氯化钴组与常氧组相比显著增加OCT-4mRNA的表达（P<0.05），塞来昔布组对氯化钴诱导的OCT-4mRNA表达增加有抑制作用，且成剂量依赖性（P<0.05）。
表1RT-PCR检测胃癌SGC7901OCT-4mRNA的相对表达量
组别OCT-4mRNA/GAPDH
正常对照组0.4108±0.0175
Co组0.5172±0.0622
Co+Cel组10.4296±0.0394
Co+Cel组20.3396±0.0341
3.讨论
近年来，国内外研究表明，NSAIDs可以抑制消化道肿瘤的生成，选择性的COX-2抑制剂克服了传统NSAIDs的缺点，有望成为消化道肿瘤的防治提供新思路。1955年Thomlinsonetal首次发现人类肿瘤中存在肿瘤组织内低氧现象,随着低氧检测技术的不断完善,越来越多的证据表明人类肿瘤普遍存在低氧微环境,低氧微环境使肿瘤对放化疗及手术治疗的疗效明显下降。1996年Brizeletal首次发现人类肿瘤远处转移与肿瘤低氧微环境有着密切的相关性。低氧引起肿瘤细胞发生一系列生物学改变,如细胞代谢的变化、基因表达及基因表型改变、蛋白合成变化等[5-6]。低氧可以活化多种肿瘤干细胞相关基因，其中包括转录因子家族POU。OCT-4为POU同源结构域转录因子家族成员，在多向分化胚胎干细胞中表达[7]。研究表明，OCT-4基因在肿瘤干细胞中表达明显高于已分化细胞，因此，抑制其表达可促进肿瘤细胞的分化，降低肿瘤恶性程度。本实验进一步研究了选择性COX-2抑制剂Cel对Co刺激的SGC-7901细胞株OCT-4表达的影响。结果显示,Cel呈剂量依赖性地抑制OCT-4mRNA的表达。本研究结果为塞来昔布抗胃癌癌作用的机制提供了新的实验依据。因此，包括塞来昔布在内的选择性COX2抑制剂更有可能为治疗胃癌开辟新的途径。
参考文献
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