大肠杆菌镁离子转运蛋白CorA结构与功能的研究

论文摘要

Mg2+是生命必需的二价阳离子之一,CorA是第一个克隆得到的Mg2+转运蛋白基因,是维持原核生物细胞内Mg2+平衡最为重要的Mg2+转运系统之一,其同源基因广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,形成了庞大的CorA转运体家族。在前人工作的基础上,本文采用抗体标记方法对大肠杆菌、海栖热孢菌CorA的拓朴性质进行研究;利用电子显微学和荧光光谱技术对大肠杆菌CorA间质结构域（CorA-PPD）的寡聚结构与功能进行了解析;此外,本文也对大肠杆菌CorA间质结构域区转运功能相关氨基酸残基进行了筛选鉴定,并建立了大肠杆菌CorA脂质体功能重组和转运活性测定技术平台。本文首先对大肠杆菌和海栖热孢菌CorA的拓朴结构进行比较研究,证明大肠杆菌CorA的N-、C-末端分别位于间质区和胞质侧;海栖热孢菌CorA的N-、C-末端均位于胞质侧。结合前人的研究结果,推断两者具有不同的拓朴结构:大肠杆菌CorA的N-端可溶性片断位于间质区,具有三个跨膜片断;而海栖热孢菌CorA仅具两个穿膜螺旋,N-端可溶性片断位于胞质侧。利用电子显微学的方法对大肠杆菌CorA-PPD的寡聚结构进行了研究,获得了N-端带GST标签的大肠杆菌CorA-PPD在脂单层膜上形成的二维晶体和CorA-PPD在水溶液中的单颗粒重构结构模型。上述结果表明大肠杆菌CorA-PPD以同源四聚体形式存在,中心具有一孔状结构,整体呈“金字塔”形。利用荧光光谱法对CorA-PPD的离子结合活性测定结果显示上述观察到的CorA-PPD同源四聚体具有同全长CorA基本相同的离子结合活性,提示“金字塔”形的同源四聚体构造可能为大肠杆菌CorA-PPD的功能寡聚状态。此外,通过对大肠杆菌CorA间质结构域区氨基酸残基的点突变研究证明了Tyr152的羟基基团及其空间位置对于CorA转运功能具有非常重要的作用。建立了CorA蛋白脂质体功能重组和转运活性测定平台,生化检测表明蛋白脂质体中CorA蛋白插入方向、封闭性等各项指标均符合转运活性测定要求;转运活性测定结果证实大肠杆菌CorA蛋白在脂质体中具有和天然状态下基本相同的米氏常数,并初步提示大肠杆菌CorA可能以一种“泄漏”的方式对Ni2+、Co2+进行转运,跨膜电势和外碱内酸的pH梯度对其均有明显的驱动效应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 2+的生物化学概述'>1.1 Mg²⁺的生物化学概述
• 2+的化学性质'>1.1.1 Mg²⁺的化学性质
• 2+转运研究中的Mg²⁺测量技术'>1.1.2 Mg²⁺转运研究中的Mg²⁺测量技术
• 1.1.2.1 原子吸收分光光度法
• 2+同位素的应用'>1.1.2.2 Mg²⁺同位素的应用
• 1.1.2.3 荧光探针的应用
• 1.1.2.4 其他测定技术
• 2+转运系统'>1.2 原核生物Mg²⁺转运系统
• 2+转运系统'>1.2.1 MgtA/B Mg²⁺转运系统
• 1.2.1.1 MgtA/B 的转录调控与生理作用
• 1.2.1.2 MgtA/B 的结构与功能
• 2+转运系统'>1.2.2 MgtE Mg²⁺转运系统
• 2+转运系统'>1.2.3 CorA Mg²⁺转运系统
• 1.2.3.1 CorA 物种分布和分类
• 1.2.3.2 CorA 的生理功能
• 1.2.3.3 CorA 的拓朴结构
• 1.2.3.4 海栖热孢菌CorA 的晶体结构概述
• 1.2.3.5 海栖热孢菌CorA 的别构调节位点
• 1.2.3.6 海栖热孢菌CorA 晶体结构表面的电荷分布
• 2+转运通道'>1.2.3.7 海栖热孢菌CorA 的Mg²⁺转运通道
• 1.2.3.8 海栖热孢菌CorA 转运过程中的“开/关”循环模型
• 2+转运系统简介'>1.3 其他Mg²⁺转运系统简介
• 1.3.1 阳离子通道类
• 1.3.2 Na/K 交换体类
• 1.4 本研究的意义
• 第2章 大肠杆菌CORA 拓朴结构的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与试剂
• 2.1.3 酵母突变体互补测试
• 2.1.4 细菌原生质体制备
• 2.1.5 抗体标记及免疫测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 EcCorA 转运活性的酵母突变体互补测定
• 2.2.2 添加N-、C-端融合标签EcCorA 蛋白转运活性的互补检测
• 2.2.3 重组CorA 蛋白N-、C-端6×组氨酸标签的位置检测
• 2.2.4 带有N-和C-末端6×组氨酸标签的Tm CorA 转运活性的互补测定
• 2.2.5 TmCorA N-、C-末端位置测定
• 2.3 讨论
• 第3章 大肠杆菌CORA 间质结构域结构与功能的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与培养基
• 3.1.2 PPD、C191A、PPDH 表达质粒构建
• 3.1.3 EcCorA-PPD 相关蛋白的表达与纯化
• 3.1.4 EcCorA 蛋白的表达与纯化
• 3.1.5 GST-EcCorA-PPD、EcCorA-PPD 的电镜观察及图像处理
• 3.1.6 园二色光谱测定
• 3.1.7 荧光光谱法测定底物结合/解离常数
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 EcCorA-PPD 相关蛋白表达条件的优化
• 3.2.2 EcCorA-PPD 相关蛋白的提取与亲合纯化
• 3.2.3 GST-EcCorA-PPD 在磷脂单层膜上的二维晶体结构
• 3.2.4 EcCorA-PPD 在水溶液中的结构
• 3.2.5 EcCorA-PPD 和EcCorA 具有相似的二级结构
• 3.2.6 EcCorA-PPD 和EcCorA 具有相似的底物结合能力
• 3.3 讨论
• 第4章 大肠杆菌CORA 间质结构域区转运相关氨基酸残基的点突变分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 试剂与培养基
• 4.1.3 酵母的遗传转化
• 4.1.4 酵母转化子EcCorA 表达水平的检测
• 2+缺陷生长表型鉴定'>4.1.5 Mg²⁺缺陷生长表型鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 EcCorA 的删除突变分析
• 4.2.2 EcCorA 的点突变体蛋白在酵母的表达水平检测
• 4.2.3 EcCorA 的点突变分析
• 4.3 讨论
• 第5章 大肠杆菌CORA 脂质体功能重组及转运动力学特性的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 EcCorA 蛋白的提取与纯化
• 5.1.2 E. coli 总膜脂脂质体的制备
• 5.1.3 EcCorA 的功能重组
• 5.1.4 EcCorA 转运活性的测定
• 5.1.5 数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 EcCorA 的重组
• 5.2.2 EcCorA 重组脂质体形态及完整性的检测
• 5.2.3 EcCorA 蛋白插入方向的检测
• 5.2.4 蛋白脂质体跨膜电势梯度的建立
• 5.2.5 Calcein 荧光探针的标定
• 5.2.6 EcCorA 转运活性的测定
• 5.2.7 EcCorA 转运体转运参数的测定
• 5.2.8 EcCorA 转运体驱动力来源的初步测定
• 5.3 讨论
• 第6章 论文总结
• 6.1 论文总结
• 6.2 工作中待解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间的研究成果及发表的论文