产共轭亚油酸丙酸菌的筛选及发酵条件研究

论文摘要

亚油酸（Linoleic Acid; LA）是人体必需的三大不饱和脂肪酸之一,作为亚油酸异构体的共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid; CLA）因其具有多种重要生理功能而备受关注。目前CLA的生产主要是采用化学法,而利用生物转化法生产CLA也日渐成为研究的热点。本论文通过建立简单的CLA含量测定方法,从食品中分离筛选出产CLA量较高的丙酸菌菌株,并对筛选所得菌株的培养基和发酵转化条件进行优化以提高其产量,本论文的主要研究内容和结果如下：1.自奶酪中筛选获得具有产CLA能力的菌株共13株,其中菌株PF-3的相对最好,其产CLA能力为38.41μg·mL-1。利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对发酵产物进行检测,进一步确认菌株PF-3具备产CLA的能力。通过常规鉴定手段对菌株PF-3进行鉴定,鉴定结果显示该菌株为费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）。2.对不同的培养基进行了初步优化,确定了MRS培养基作为发酵培养基。通过正交实验和响应面法（RSM）优化研究了丙酸杆菌PF-3发酵生产CLA的培养基成分和发酵条件。得到的最优培养基成分为：蛋白胨（2%）、牛肉膏（1%）、酵母膏（0.5%）、葡萄糖（2.5%）、乙酸钠（0.5%）、柠檬酸铵（0.3%）、磷酸氢二钾（0.2%）、硫酸锰（0.02%）、硫酸镁（0.02%）。最佳发酵条件为：菌体接种量10.2%（v/v）,LA添加量0.075%,pH6.75,反应温度31℃, Tween-80作为乳化剂（LA/Tween-80为1：20）的条件下,厌氧振荡培养36h。菌株PF-3在优化后的条件下,其CLA产量为63.58μg-mL-1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 共轭亚油酸的研究概况
• 1.2 共轭亚油酸的生理学功能及应用
• 1.2.1 抗癌作用及机理
• 1.2.2 抗动脉粥样硬化作用
• 1.2.3 降低脂肪沉积作用
• 1.2.4 增强免疫作用
• 1.2.5 改善骨组织代谢
• 1.2.6 在食品工业中的应用
• 1.2.7 在禽畜业中的应用
• 1.3 CLA的化学合成
• 1.3.1 碱性异构法
• 1.3.2 金属催化异构法
• 1.3.3 羟基脂肪酸脱水法
• 1.4 CLA的生物合成
• 1.4.1 瘤胃菌
• 1.4.2 乳酸菌
• 1.4.3 丙酸菌
• 1.5 CLA的纯化方法
• 1.5.1 尿素包合法
• 1.5.2 低温结晶法
• 1.5.3 吸附分离法
• 1.5.4 脂肪酶浓缩法
• 1.5.5 超临界流体萃取法
• 1.6 CLA的检测方法
• 1.6.1 紫外光谱法（UV）
• 1.6.2 红外光谱法（IR）
• 1.6.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.6.4 气相色谱法（GC）
• 1.6.5 气-质联用法（GC-MS）
• 1.7 本课题的研究目的及内容
• 第2章 产CLA丙酸菌的筛选与鉴定
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种的分离筛选
• 2.2.2 样品处理及筛选方法
• 2.2.2.1 样品处理
• 2.2.2.2 溴甲酚紫平板厌氧培养
• 2.2.2.3 平板划线初筛
• 2.2.2.4 复筛
• 2.2.3 紫外分光光度法检测CLA
• 2.2.3.1 LA和CLA吸收峰的测定
• 2.2.3.2 CLA紫外吸收标准曲线的绘制
• 2.2.4 发酵培养液中脂肪酸的萃取与紫外检测
• 2.2.5 GC-MS分析发酵液脂肪酸产物
• 2.2.5.1 脂肪酸的皂化和甲酯化
• 2.2.5.2 气相色谱条件
• 2.2.5.3 质谱条件
• 2.2.6 革兰氏染色、显微形态和培养特征观察
• 2.2.7 理化特性鉴定
• 2.2.7.1 单糖发酵试验
• 2.2.7.2 明胶液化试验
• 2.2.7.3 七叶苷试验
• 2.2.7.4 淀粉水解试验
• 2.2.7.5 V-P试验
• 2.2.7.6 甲基红试验
• 2.2.7.7 硝酸盐还原试验
• 2S试验'>2.2.7.8 H₂S试验
• 2.2.7.9 石蕊牛乳试验
• 2.2.7.10 吲哚试验（靛基质试验）
• 2.2.7.11 运动性试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 LA和CLA特征吸收峰的确定
• 2.3.2 CLA标准曲线的绘制
• 2.3.3 产CLA菌株的筛选
• 2.3.3.1 紫外检测结果
• 2.3.3.2 GC-MS分析
• 2.3.4 菌株PF-3的鉴定结果
• 2.3.4.1 革兰氏染色、显微形态和培养特征
• 2.3.4.2 生理生化试验结果
• 2.4 本章小结
• 第3章 费氏丙酸杆菌生产CLA发酵条件的研究
• 3.1 材料与设备
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要试剂和仪器
• 3.1.3 培养基
• （1） 玉米浆培养基
• （2） 脱脂乳培养基
• （3） MRS培养基
• （4） 乳酸钠培养基
• （5） LB培养基
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 发酵培养基的优化
• 3.2.1.1 不同培养基的优化
• 3.2.1.2 碳源的优化
• 3.2.1.3 氮源的优化
• 3.2.1.4 氮源比例的确定
• 3.2.1.5 无机盐的优化
• 3.2.1.6 无机盐比例的确定
• 3.2.2 发酵条件的优化
• 3.2.2.1 培养方式对CLA产量的影响
• 3.2.2.2 培养时间对CLA产量的影响
• 3.2.2.3 LA添加量对CLA产量的影响
• 3.2.2.4 培养温度对CLA产量的影响
• 3.2.2.5 接种量对CLA产量的影响
• 3.2.2.6 pH对CLA产量的影响
• 3.2.2.7 乳化剂对CLA产量的影响
• 3.2.2.8 响应面法（RSM）优化菌株发酵条件
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 培养基的优化结果
• 3.3.1.1 不同培养基的影响
• 3.3.1.2 碳源的优化结果
• 3.3.1.3 氮源的优化结果
• 3.3.1.4 无机盐比例的优化结果
• 3.3.2 发酵条件的优化结果
• 3.3.2.1 培养方式的影响
• 3.3.2.2 培养时间的影响
• 3.3.2.3 LA添加量的影响
• 3.3.2.4 接种量的影响
• 3.3.2.5 培养温度的影响
• 3.3.2.6 pH值的影响
• 3.3.2.7 乳化剂的影响
• 3.3.2.8 响应面法（RSM）优化结果
• 3.4 本章小结
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献