论文摘要
本实验以野生型t-PA cDNA序列为摸板,根据t-PA的结构和功能,利用PCR技术进行改构研究。首次获得了人组织型溶酶原激活剂t-PA cDNA的缺失突变体rPA;根据t-PA氨基酸序列中所存在的纤溶酶原激活剂抑制剂-1（PAI-1）作用位点（Lys296-Arg299）与α2-抗纤溶作用位点（Ala473）,在国内首次构建了rPA的定点突变体rPA（KHRR296-299AAAA）,rPA（A473S）和两者的复合突变体rPA（KHRR296-299AAAA/A473S）。通过基因克隆构建了以上突变体的原核表达载体pErA、pErA（K）、pErA（KA）、pErA（A）和真核表达载体pCSRA与pCSRK。将rPA及其突变体分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体中进行表达,并对上述表达载体在CHO-dhfr-的稳定表达作了探索。结果显示,①原核表达载体的表达产物与抗t-PA抗体呈阳性反应,复性产物具有明显的体外纤溶活性;②真核表达载体在COS-7的瞬时表达产物经FAPA法检测氨基酸的改变对于产物的纤溶活性没有影响,表达产物有良好的溶圈活性;③获得了rPA及其突变体rPA（K）真核表达载体的CHO-dhfr-细胞克隆株,表达产物经Western blotting分析,结果表明表达产物具有特异的抗原性,纤维蛋白自显影表明,表达产物有良好的溶圈活性,细胞克隆株具有一定的稳定性。以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了物质基础;为rPA及其突变体在真核细胞的稳定转染打下了基础;稳定表达细胞株的建立为获得高表达细胞株及其在临床的广泛应用奠定了基础。
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标签：组织型纤溶酶原激活剂论文; 聚合酶链式反应论文;