细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4在小鼠海马CA1区突触可塑性及铅诱导的神经元死亡过程中的作用

论文摘要

本文应用免疫荧光、免疫沉淀、海马脑片场电位记录等技术研究了细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4在不同发育期小鼠海马CA1区突触可塑性中的不同作用,以及cyclinD1/CDK4/p—Rb信号参与了铅诱导的培养海马神经元死亡过程,并探讨了其可能涉及的上游信号通路。技术和方法:脑片场电位技术,免疫荧光,免疫沉淀,原代海马神经元培养实验结果:1)细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4在不同发育期小鼠海马CA1区突触可塑性中的不同作用在本研究中,我们发现在出生10天的小鼠海马CA1区,CDK4在锥体细胞的核中和胞质中都有分布,但核中分布较多;而在28天的小鼠海马CA1区,CDK4主要定位于胞质,甚至在树突中也有分布。用CDK4抑制剂处理的出生8-15天及21-35天的小鼠海马脑片中,都发现短时程突触可塑性（STP）的削弱。然而,在CDK4抑制剂处理的出生21-35天的小鼠海马脑片上,双脉冲异化（PPF）却没有明显改变。在小鼠海马CA1区用强直刺激诱导的长时程增强（LTP）没有受到CDK4抑制剂的影响。我们还发现,在分别用CDK4抑制剂预处理两个不同发育阶段的小鼠海马脑片上,由代谢型谷氨酸一型受体的激动剂或低频双脉冲刺激诱导的长时程抑制（mGiuR-LTD）都受到了损伤。但是在21-35天的小鼠海马上,CDK4抑制剂引起的mGluR-LTD的损伤,没有在8-15天的小鼠海马脑片上引起的损伤显著。我们的这些结果表明:cyclinD1-CDK4复合物的表达和活化参与了小鼠海马CA1区短时程突触可塑性和代谢型谷氨酸受体依赖的LTD的维持过程,并且提出,在发育的不同阶段,cyclinD1-CDK4在小鼠海马CA1区突触传递功能中可能起不同的作用。2)细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4及其下游的p-Rb参与了铅诱导的培养海马神经元死亡过程,并且可能是通过PI3K/AKT通道介导的铅的神经毒性其中一个重要的表现就是会导致神经元死亡。并且铅是如何导致神经元死亡的机制目前还不清楚。我们应用免疫荧光以及免疫沉淀等方法在原代培养的大鼠海马神经元上,研究了铅暴露引起的神经元死亡过程中,细胞周期蛋白cyclinD1/CDK4,它的下游底物pRb,以及其特定的上游信号phosphoinositide 3-kinase（PI3K）/AKT通路的作用。结果表明,铅暴露处理原代培养海马神经元会导致剂量依赖的神经元死亡。抑制CDK4的活性,会显著的降低铅诱导的这种类型的神经元死亡,但是这种保护作用是不完全的。另外,铅暴露处理后,cyclinD1的表达水平和pRb/p107的磷酸化水平与对照组相比都显著升高。这种升高能够持续48小时,并且在72h后会恢复到对照组的水平。为了明确CDK4在神经元内的分布和表达,我们采用CDK4与神经元标记物微管相关蛋白-2（MAP-2）双标记的方法。在对照组中,在神经元的胞质和胞核均有CDK4存在;在用铅离子孵育的神经元中,CDK4只分布于胞核中。并且多数CDK4和p-Rb阳性细胞与TUNEL阳性细胞共分布。加入PI3K的抑制剂LY294002（30μM）或wortmannin（100nm）能够显著的提高神经元的存活率。另外,阻断PI3K/AKT信号通路的活性后,抑制了铅暴露诱导的cyclinD1的表达水平和部分p-Rb/p107的表达水平的升高。以上结果表明,cyclinD1/CDK4/pRb信号通路参与了铅诱导的神经元死亡过程,并且铅离子通过激活PI3K/AKT通路从而诱导cyclinD1和部分p-Rb的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 综述篇
• 第一章 MAPK信号通路与突触可塑性
• 1.1 神经系统ERK信号的功能
• 1.1.1 ERK参与突触可塑性形成
• 1.1.2 ERK在学习和记忆中的作用
• 1.1.3 ERK调节突触传递
• 1.1.4 突触形态的改变需要ERK激活
• 1.1.5 ERK在突触可塑性中的底物
• 1.1.6 ERK信号在神经系统中的重要作用
• 1.2 P38MAPK激酶及其功能
• 1.2.1 P38MAPK信号在神经元可塑性中的作用
• 1.3 有待解决的相关问题
• 参考文献
• 第二章 细胞周期相关蛋白的活化在神经元死亡中的作用
• 2.1 引言
• 2.2 营养缺失体外模型中,细胞周期相关蛋白的表达和神经元凋亡的关系
• 2.3 细胞周期活化对神经元DNA损伤的响应
• 2.4 细胞周期相关蛋白的表达和兴奋性毒性引起的神经退行
• 2.5 细胞周期的活化对Aβ淀粉肽引起的神经毒性的反应
• 2.6 在神经元死亡过程中,是何时,以何种方式导致细胞周期活化
• 2.7 总结
• 参考文献
• 第三章 铅的神经毒性及其细胞分子机制
• 3.1 简介
• 3.2 背景
• 3.3 钙离子及锌离子蛋白结合位点
• 3.4 铅暴露引起的细胞损伤
• 3.5 细胞离子通道和重金属
• 3.6 铅的神经毒性
• 3.7 结论
• 参考文献
• 实验篇
• 第四章 细胞周期蛋白cyclinD1-CDK4在不同发育阶段小鼠海马CA1区突触可塑性中的作用
• 4.1 研究背景
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 CyclinD1-CDK4在不同发育阶段的小鼠海马CA1区的定位
• 4.3.2 CDK4抑制剂不影响小鼠海马基础突触传递效率
• 4.3.3 CyclinD1-CDK4在发育早期参与了短时程突触可塑性过程
• 4.3.4 CyclinD1-CDK4 inhibitor不影响海马CA1区LTP的诱导和维持过程
• 4.3.5 海马CA1区mGluR-dependent LTD需要cyclinD1-CDK4的参与
• 4.4 讨论和分析
• 4.4.1 不同发育时期CyclinD1-CDK4的神经元表达和亚细胞定位
• 4.4.2 CyclinD1-CDK4介导了小鼠海马短时程突触可塑性过程
• 4.4.3 CyclinD1-CDK4不参与海马CA1区LTP的诱导和维持过程
• 4.4.4 cyclinD1-CDK4参与了mGluR依赖的LTD过程
• 参考文献
• 第五章 CyclinD1/CDK4参与了铅暴露引起的神经元死亡过程,并且可能由PI3K/AKT信号通路介导
• 5.1 研究背景
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 CDK4的抑制剂在一定程度上能够抑制铅暴露引起的神经元死亡
• 5.3.2 铅暴露引起的神经元死亡过程需要cyclinD1/CDK4和pRb/p107的参与
• 5.3.3 PI3K/AKT被阻断的情况下,铅暴露引起的cyclinD1和部分p-Rb/p107表达的升高被抑制了
• 5.4 讨论
• 5.4.1 CyclinD1/CDK4参与了铅暴露引起的神经元死亡过程
• 5.4.2 pRb/p107也介导了铅暴露引起的神经元死亡过程
• 5.4.3 铅暴露诱导的cyclinD1和pRb/p107表达水平的升高依赖于PI3K/AKT信号通路
• 参考文献
• 附录 个人简历