表皮细胞的生物反应器培养及其创面递呈

论文摘要

目的：治疗用表皮细胞的放大培养及其向创面递呈。方法：组织工程皮肤的构建中,生物反应器的应用是其必经之路,但是目前尚没有有关组织工程皮肤生物反应器设计的优化方法；本研究应用CFD技术对已经使用及正在设计中的灌流式生物反应器进行了模拟,从培养室内流体的流动速度、压力、湍流动能及湍流耗散率以及平均粒子停留时间等方面对两种结构及两种不同的灌流方式的组织工程皮肤生物反应器进行了考察,发现圆柱形双入口及双出口的灌流方式的流场运动方式及其传质性能均优于单口灌流（方形及圆柱形）模式,尤其是在生物反应器并联使用时,距离灌流入口远近侧的圆柱形结构的单灌流培养室内的呈现不同的流体动力学状态,近侧的灌流式可以得到良好的灌流,而远侧的培养室内得到的灌流很少。通过CFD的模拟我们认为,圆柱形双灌流模式是灌流式组织工程皮肤生物反应器的良好设计模式。表皮细胞在组织工程皮肤的构建、烧伤及慢性创面的治疗中有极其重要的地位,是完成创面上皮化的关键细胞；创面治疗中最为理想的表皮细胞应该来源于病人的自身,而在短时间内表皮细胞的大规模获取及大量扩增又构成了新的障碍,这也是限制组织工程皮肤及表皮细胞膜片等应用的主要难题,本研究对表皮细胞的获取、细胞外基质对表皮细胞粘附能力的影响、培养基的改进及表皮细胞培养方法、表皮细胞的生物反应器培养以及表皮细胞向创面递呈等环节进行优化,首先,对表皮细胞的消化方式进行了优化,采用了三维环形摆动的动力下对表皮细胞进行消化,以在第一环节获取大量的表皮细胞；其次,本研究分析了不同细胞外基质对表皮细胞的粘附能力的影响,通过对比观察,我们发现经过反复冻融的HaCat细胞外基质及角质细胞的细胞外基质对表皮细胞的选择性粘附较为明显,而成纤维细胞的细胞外基质对表皮内的多种细胞均有粘附作用,Ⅳ型胶原对表皮细胞的粘附作用相对较低,含5%胎牛血清的改良表皮细胞培养基与含10%胎牛血清的改良表皮细胞培养基可促进表皮内多种细胞的粘附,并可在原代培养中存活,使用无血清表皮细胞培养基并且没有细胞外基质时,表皮细胞的粘附很少,并且血清与细胞外基质并无明显的协同作用,提示这两种促进表皮细胞粘附的方式相互独立；此外我们还注意到,有成纤维细胞存在时,原代表皮细胞有较好的生长状态,而去除成纤维细胞时,表皮细胞生长变得缓慢；当培养面积足够时,含5%胎牛血清的培养条件下,培养体系内的成纤维细胞可以维持生长,且对原代培养的表皮细胞并不构成竞争威胁,同时,基于应用的角度考虑,表皮细胞培养体系内存在成纤维细胞可使表皮细胞对创面的促进愈合作用更强。这部分的结果使我们认为在表皮细胞的生物反应器扩增时,可采用低血清表皮培养基以促进表皮细胞的粘附及在培养体系内存留少量的成纤维细胞,由于血清对表皮细胞的粘附作用独立于细胞外基质,因此,可以不使用细胞外基质对用于培养表皮细胞的微载体进行改性。第三,使用生物反应器对表皮细胞进行大规模的扩增；表皮细胞是贴壁依赖性细胞,体外培养时需要有合适的贴附表面,在搅拌式生物反应器的培养方式是悬浮式培养,因此需要微载体来提供贴附表面；在微载体的选择中,有需要考虑到表皮细胞培养的目的—用于烧伤或慢性创面的治疗,因此本研究中选择了明胶交联的可生物降解的商业化微载体（Cultispher G）,在初始化培养阶段,通过血清及静置以使表皮细胞粘附于微载体上,然后进行间歇式搅拌培养,搅拌速度从35rpm逐渐增加到55rpm,静止间隔时间也逐渐缩短,通过这种培养方式,我们成功地在较短的时间内于250ml生物反应器中大量扩增出了表皮细胞,这些表皮细胞均贴附在微载体的表面或微载体的内部生长,通过Massion三色染色,我们发现这种培养方法培养的部分微载体上有新生胶原的合成,但是通过群体倍增时间我们发现,生物反应器培养方式的表皮细胞群体倍增时间与静态培养的表皮细胞群体倍增时间比较并无明显的优势,提示表皮细胞在生物反应器的扩增主要是通过培养面积及培养容积的增加而实现。第四,新鲜的表皮细胞及培养的表皮细胞均可以应用于创面,因为未复层化的表皮细胞中的表皮干细胞含量较多,因此未复层化的表皮细胞对创面的上皮化作用更强,不合适的递呈方法将表皮细胞向创面进行递呈时会导致细胞的损伤及丢失,而过于繁缛的递呈方法其临床应用价值有限,本研究中使用了纤维蛋白胶作为细胞的运输工具,通过专用的注射器,可将表皮细胞递呈并粘附于创面,同时纤维蛋白胶在创面形成的凝胶还可以保护创面。通过动物实验观察,我们发现,含有表皮细胞递呈于创面后,均可在两周的时间完成创面的上皮化,而单纯的纤维蛋白胶伤口愈合的时间需要两周以上,新鲜未培养的表皮细胞及经过生物反应器扩增的微载体-表皮细胞应用后的,其组织学形态、新生表皮的厚度、表皮干细胞的分布以及表皮细胞在创面上的增殖特性等方面均相似,而静态培养的表皮细胞应用于创面后形成的新生表皮较薄,表皮干细胞量较少,增殖能力也相对低下；创面单纯应用纤维蛋白胶覆盖时,创面愈合方式为疤痕愈合,上皮化不全。裸鼠皮下注射微载体-表皮细胞后未发现恶性生长,微载体在体内聚集并缓慢降解,积聚的团块内有大量的细胞及新生血管。结论：本研究通过不同的方式对表皮细胞的获取及其培养方式进行了探索,成功优化了表皮细胞的获取方法及其在生物反应器中的放大培养,并通过动物实验,证实了新鲜表皮细胞悬液及微载体-表皮细胞悬液在创面愈合中的价值。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩略词对照表
• 目录
• 1 组织工程皮肤构建的生物反应器流体力学性能的探讨
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 1.6 参考文献
• 2 表皮细胞分离方法的优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 2.6 参考文献
• 3 贴壁方法筛选表皮细胞及表皮细胞培养方式的探讨
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 3.6 参考文献
• 4 表皮细胞结合微载体技术的生物反应器扩增
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 4.6 参考文献
• 5 不同方式递呈的表皮细胞对创面愈合过程的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.6 结论
• 5.7 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在读期间发表的论文