金黄色葡萄球菌肠毒素C2His118定点突变研究

论文摘要

超抗原（Superantigen,SAg）是一类具有多种免疫活性的蛋白分子,能大量激活T细胞。与普通抗原不同,超抗原无需抗原提呈细胞的加工处理,以完整蛋白形式结合于MHCⅡ（Major histocompatibility complex classⅡmolecules,MHCⅡ）类分子结合槽的外侧及T细胞表面TCR Vβ（Variable pacts ofthe T cellreceptor,TCR Vβ）区。微量超抗原即可产生大量有生物学活性的细胞因子和药性效应,引发超级抗原依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Superantigen dependentcell-mediated cytotoxicity,SDCC）和其它免疫效应,从而可在体内抑制肿瘤细胞生长。Staphylococcus enterotoxin C2（SEC2）作为由金黄色葡萄球菌产生的超抗原,在临床已被用于肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大肠癌、血癌、膀胱癌等恶性肿瘤的治疗,效果极为显著。但作为潜在的肠胃毒素,SEC2会引起呕吐、腹泻等症状,严重限制了其在肿瘤治疗中的应用。肠毒素分子结构与其致病性、致病能力关系密切,肠毒素所引发的催吐效应和T细胞诱导效应无关,而与His118有关。本研究利用PCR介导的定点突变技术,对sec2基因中的His118密码子实行定点突变,获得突变体蛋白。通过刺激鼠脾淋巴细胞增殖和胰酶稳定性研究,分析突变体蛋白的超抗原活性及胰酶稳定性。通过对人大肠癌细胞CX-1抑瘤研究,确认突变体抑瘤效果。本研究结果如下:应用MutanBEST Kit试剂盒,以pET-28a-SEC2为模板进行PCR扩增,获得SEC2突变体表达质粒:pET-28aoSEC2（H118Y）。SEC2突变基因在大肠杆菌中经IPTG诱导,实现高效表达。经Ni-NTA亲和层析柱和Sephadex G-75纯化,获得高纯度的突变体蛋白。在胰蛋白酶与突变体蛋白的质量比在1:200的条件下,观察突变体蛋白胰酶稳定性。SDS-PAGE结果表明,突变体蛋白SEC2（H118Y）胰酶稳定性较好,略低于SEC2。鼠脾淋巴细胞增殖和体外抑瘤结果表明,突变体蛋白可有效刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,表明所获得突变体蛋白的超抗原活性没有因为118位His的定点突变而改变。此外,突变体蛋白可明显抑制人大肠癌细胞Cx-1的生长,抑瘤效果与SEC2相似。

论文目录

• 内容摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 超抗原
• 1.2 金黄色葡萄球菌肠毒素
• 1.3 SEC2临床应用与本研究的目的和意义
• 第二章 实验材料与基本实验方法
• 2.1 材料
• 2.2 常用实验操作方法
• 第三章 SEC2His118定点突变研究
• 3.1 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 突变体蛋白胰酶稳定性研究
• 4.1 实验目的
• 4.2 方案设计
• 4.3 实验材料和试剂
• 4.4 实验方法
• 4.5 实验结果
• 4.6 讨论
• 第五章 突变体蛋白生物活性研究
• 5.1 实验目的
• 5.2 方案设计与分析
• 5.3 实验材料与试剂
• 5.4 实验方法
• 5.5 实验结果与讨论
• 5.6 小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录