CCL21/CCR7在结肠癌侵袭与转移过程中生物学意义的研究

论文摘要

第一部分结肠癌中CCR7、MMP-9的表达及其临床意义目的：检测趋化因子受体CCR7（C-C chemokine receptor 7）、金属基质蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）在结肠癌组织中的表达，并探讨其与临床病理特征的关系；分析4株结肠癌细胞中CCR7的表达，为相关体外实验提供基础。方法：免疫组织化学链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（streptavidin-biotinperoxidase complex，SABC）检测65例结肠癌根治术后组织标本中CCR7、MMP-9的表达，结合临床病理资料进行回顾分析；RT-PCR和Western blot检测结肠癌细胞株SW480、LoVo、HT-29、Caco-2中CCR7 mRNA及蛋白的表达水平。结果：结肠癌组织中CCR7的表达率为63．1％（41／65），MMP-9的表达率为75．4％（49／65）；CCR7和MMP-9的表达与结肠癌的浸润深度、淋巴结转移相关（P＜0．05），而与患者年龄、性别、肿瘤部位及大小无关（P＞0．05）。CCR7（+）和CCR7（-）结肠癌组织中MMP-9的表达率分别为90．2％（37／41）和50．0％（12／24）；MMP-9（+）和MMP-9（-）结肠癌组织中CCR7的表达率分别为85．5％（37／49）和25．0％（4／16），两者的表达呈相关性（P＜0．05）。RT-PCR与Western blot结果显示，CCR7 mRNA和蛋白在4株结肠癌细胞中均有表达，以SW480中表达最强，LoVo、HT-29次之，Caco-2表达量最弱。结论：结肠癌中CCR7、MMP-9蛋白表达与结肠癌淋巴结转移密切有关。结肠癌细胞株SW480可作为CCR7相关体外实验的研究对象。第二部分CCR7-shRNA表达载体的构建及对SW480细胞的沉默效应目的：设计并构建靶向CCR7基因短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达质粒，并检测其对人结肠癌SW480细胞中CCR7表达的干扰效果。方法：以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸，退火形成互补双链结构，再克隆至pGC-silencer-CRM30载体，构建的3条重组shRNA真核表达质粒分别命名为pGC-silencer-CRM30CCR7A、CCR7B和CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的3条shRNA真核表达质粒转染人结肠癌SW480细胞，荧光显微镜观察转染效果，RT-PCR法检测CCR7 mRNA干扰效果，优化转染条件，以实现最佳干扰效果；选取干扰效果最佳的1条shRNA真核表达质粒转染SW480细胞，并通过G418筛选稳定表达CCR7-shRNA的细胞株。结果：重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符，转染SW480细胞后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白；RT-PCR结果显示，pGC-silencer-CRM30CCR7 C干扰效果最强。将pGC-silencer-CRM30CCR7C转染SW480细胞，并通过G418筛选稳定表达CCR7-shRNA的细胞株，命名为CCR7-shRNA SW480细胞；RT-PCR及Westen blot结果显示，CCR7表达被沉默。结论：靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误，并获得稳定表达CCR7-shRNA的细胞株；为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。第三部分CCL21／CCR7在人结肠癌SW480细胞体外侵袭中的作用研究目的：研究趋化因子CCL21及其受体CCR7对人结肠癌SW480细胞体外侵袭能力的影响，并探讨其作用机制。方法：不同浓度的CCL21刺激亲本SW480细胞、shRNA SW480细胞及CCR7-shRNA SW480细胞，划痕实验和Transwell侵袭小室实验检测SW480细胞侵袭能力变化，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测SW480细胞中Snail mRNA的表达，免疫印迹（Western Blot）法检测金属基质蛋白酶-9（MMP-9）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。结果：CCL21促进亲本SW480细胞向划痕处爬行的迁移；10 ng／ml组（76±6）和100ng／ml组（113±7）中穿膜细胞数显著多于空白对照组（48±4）（P＜0．05）。CCL21刺激亲本SW480细胞，Snail mRNA的表达增强，E-钙黏蛋白表达减弱，MMP-9的表达增强，与空白对照组相比，均有差异有统计学意义（P＜0．05）。CCL21对shRNA SW480细胞的影响与对亲本SW480细胞的影响基本相似。CCR7-shRNA可以阻断CCL21对SW480细胞的各项刺激效应。结论：CCL21／CCR7相互作用，可通过促进Snail mRNA和MMP-9蛋白表达，降低E-钙黏蛋白水平，以增强SW480细胞的侵袭能力。第四部分CCL21／CCR7在结肠癌SW480细胞增殖及凋亡中的作用研究目的：探讨趋化因子CCL21及其受体CCR7对人结肠癌SW480增殖及凋亡的影响，并探讨及其作用机制。方法：绘制亲本SW480和CCR7-shRNA SW480的生长曲线；流式细胞仪检测亲本SW480和CCR7-shRNA SW480的细胞周期。CCL21预处理的SW480细胞在含足叶乙甙（VP-16）的体系中培养，MTT法检测细胞增殖活力，流式细胞术和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡；免疫印迹检测凋亡相关基因Bcl-2／Bax的表达。结果：细胞生长曲线图显示，CCR7-shRNASW480细胞的生长特性无明显变化；与亲本SW480细胞相比，CCR7--shRNASW480细胞周期未发生变化。CCL21单独作用不能促进SW480细胞增殖；VP-16组中SW480细胞的增殖抑制率为68．3％，CCL21预处理增强SW480细胞活力，CCL21（100ng／mL）中抑制率降至47．4％；VP-16组与CCL21（100ng／mL）组中凋亡率分别为（65．2±5．2）％和（48．7±3．1）％，差异有统计学意义（P＜0．05）。CCL21作用后，SW480细胞中Bcl-2表达升高，Bax表达降低，与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0．05），CCR7-shRNA可以阻断此效应。结论：CCL21／CCR7增强人结肠癌SW480细胞抗凋亡能力，提高其在非最适微环境中的存活能力。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• Background
• 第一部分 结肠癌中CCR7、MMP-9的表达及其临床意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 CCR7-shRNA表达载体的构建及对SW480细胞的沉默效应
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 CCL21/CCR7在人结肠癌SW480细胞体外侵袭中的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 CCL21/CCR7在结肠癌SW480细胞增殖及凋亡中的作用研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述 趋化因子及其受体在肿瘤转移中的生物学意义
• 附录 在校攻读学位期间发表论文
• 致谢