论文摘要
温度是制约植物生长及分布的重要生态因子之一,过低的温度会使植物受到伤害。越橘为杜鹃花科（Ericaeae）越橘属（Vaccimium）植物,原产于北美,为多年生灌木小浆果果树。相对于栽培种越橘,笃斯越橘是一种耐寒性极强的野生种越橘,在抗寒性研究中较有优势。前人对笃斯越橘抗寒性的研究多集中在其生理特性或次生代谢物的分离提取,关于该植物材料抗寒基因的分离鉴定以及在分子育种学上的应用价值尚未有报道。因此,克隆笃斯越橘抗寒基因,进一步分析其序列、结构与功能,对研究笃斯越橘的抗寒分子机制具有重要意义,为下一步利用该基因改良越橘抗逆性储备了宝贵的基因资源,为通过基因工程手段改良越橘的抗寒性奠定了基础。本文采用PCR技术,首次从野生种笃斯越橘中分离低温诱导转录因子DBEB基因,并进行了克隆与序列分析（基因注册号码为JF713704）；同时应用southern杂交技术对其进行了检测；对笃斯越橘转录因子DREB基因的植物表达载体的进行了构建,主要研究结果如下：1.根据GenBank上发表的近缘植物蓝莓（Blue Crop）中同源CBF基因序列在其保守区域设计两对特异引物,一对在保守区的中间部位,一对横跨保守区的两端,采用PCR的方法,对野生种笃斯越橘的转录因子DREB基因片段进行克隆,得到一大小678bp的片段,经序列分析表明,该片段包含完整的开放开放阅读框,推测的编码蛋白的氨基酸序列含225个氨基酸残基。然后利用保守区两端的特异引物,采用RT-PCR方法,对笃斯越橘转录因子DREB基因进行克隆,测序结果得到的序列与基因组PCR得到序列在编码区完全一致。应用DNAMAN软件将推测的笃斯越橘转录因子DREB基因编码区与Genbank上发表的几种植物的DREB基因进行氨基酸同源性比对,结果发现笃斯越橘CBF转录因子VuDREBl基因和桃（Prunus persica）DREB基因的氨基酸同源性为84%,与山荆子（Malus baccata）同源性为83%,这说明我们已成功克隆了笃斯越橘转录因子VuDREB基因。2.对笃斯越橘转录因子CBF基因的核苷酸序列以及由此推导出的氨基酸序列进行了序列比对和功能、结构分析,得出以下结论：1)笃斯越橘转录因子DREB基因与其它植物DREB基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性；2)笃斯越橘转录因子DREB氨基酸序列含有一个功能区AP2结合域。在AP2结合域的两端拥有PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列；3)笃斯越橘转录因子DREB拥有酸性活化区域,无核定位信号和信号肽,无跨膜结构；4)笃斯越橘转录因子DREB氨基酸序列中有和CBF家族中保守的0[螺旋区和β折叠区：5)通过对笃斯越橘转录因子DREB基因的系统发育树分析得出,笃斯越橘转录因子DREB基因与桃的DREB基因具有相近的起源。3.正在构建笃斯越橘转录因子DREB基因的植物表达载体,首先设计一对含有Xba I和SacⅠ酶切位点的特异引物,从笃斯越橘基因组DNA中分离DREB基因的编码区。然后应用限制性内切酶Xba I和Sac I分别对质粒pBI121和PCR产物进行酶切,用酶切的PCR产物替换质粒pBI121中的GUS基因。