表达裂谷热病毒糖蛋白重组山羊痘病毒的研究

论文摘要

裂谷热（Rift Valley Fever, RVF）是反刍动物和人共患的一种烈性传染病,可通过虫媒（库蚊等）及直接接触等途径传播,具有传染性强、致死率高、易感动物广泛等特性。RVF每次流行均造成巨大的社会经济损失和公共卫生危机。国际兽医局（OIE）已将RVF列为A类传染病,也是国际上重要的生物武器研究对象及生物反恐防范对象。RVF主要流行于非洲,2000年前后蔓延至中东及阿拉伯半岛。近年,南亚地区也有迹象表明存在该病毒的流行。随着全球化贸易、人员交往快速发展及全球气候变暖趋势的加速,我国面临RVF等新发传染病的威胁也越来越严重,急需开展疫苗、诊断监察技术等相关防控技术的研究。裂谷热病毒（Rift Valley Fever Virus, RVFV）为布尼安病毒科（Bunyaviridae）的Phlebovirus属成员,仅一个血清型。囊膜糖蛋白G是RVFV的主要结构蛋白及保护性免疫原,由基因组M节段编码,翻译后裂解为GN和GC两个亚单位。山羊痘病毒（Goatpox virus, GPV）宿主范围明确,主要限于山羊和牛等反刍兽。GPV基因组容量大,遗传性稳定,复制非必需区明确,可耐受大片段外源基因的插入、重组和表达,作为重组病毒载体疫苗不影响流行病血清学监测。本研究首先以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒（GPV）疫苗株为载体,以复制非必需区TK基因为插入靶点,通过同源重组,构建了痘病毒晚期启动子p11驱动、内部核糖体进入位点（ires）介导的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶基因（gpt）和绿荧光蛋白基因（gfp）串联表达的重组病毒rGPV-gpt-ires-egfp。在此基础上,进一步构建痘病毒早晚期启动子p7.5驱动RVFV保护性抗原G基因片段重组病毒rGPV-gie-rvfv-g（n+c）,利用霉酚酸（Mycophenolic acid, MPA）药物筛选后,经PCR、Western-blot和IFA（间接免疫荧光）方法证实G蛋白在重组病毒中稳定表达,并被有效裂解为GN和GC两个亚单位,重组病毒具有良好细胞生长特性。本研究为RVF重组山羊痘病毒活载体疫苗的研制奠定了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 裂谷热概述
• 1.3 裂谷热病毒概述
• 1.3.1 裂谷热病毒分类及种群
• 1.3.2 RVFV 形态特征
• 1.3.3 RVFV 基因组结构
• 1.3.4 RVFV 理化特性
• 1.3.5 RVFV 血凝特性
• 1.3.6 RVFV 抗原性
• 1.3.7 RVFV 复制过程
• 1.3.8 RVFV 遗传变异
• 1.3.9 RVFV 传播媒介与传播途径
• 1.3.10 RVFV 宿主
• 1.3.11 RVFV 血清学试验
• 1.3.12 RVFV 分子生物学研究进展
• 1.3.13 RVF 在历史上的主要流行情况
• 1.3.14 疫苗
• 1.4 山羊痘病毒概述
• 1.4.1 山羊痘概述
• 1.4.2 山羊痘病毒载体的优越性
• 1.5 本论文主要研究内容
• 2. 材料和方法
• 2.1 表达绿色荧光蛋白的重组山羊痘病毒构建的材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 裂谷热病毒糖蛋白在重组山羊痘病毒中表达、纯化的材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 3. 结果和分析
• 3.1 表达绿色荧光蛋白重组山羊痘病毒构建结果分析
• 3.1.1 ires-egfp 基因的扩增和序列测定
• 3.1.2 转移载体pTK-gpt-ires-egfp 的构建
• 3.1.3 gfp 在rGPV-gpt-ires-egfp 中的表达
• 3.2 裂谷热病毒糖蛋白在重组山羊痘病毒中表达与纯化结果分析
• 3.2.1 转移载体pTK-gie-rvfv-g（n+c）的构建
• 3.2.2 重组病毒rGPV-gie-rvfv-g（n+c）的构建、PCR 鉴定与纯化
• 3.2.3 重组病毒rGPV-gie-rvfv-g（n+c）的Western-blot 鉴定
• 3.2.4 重组病毒rGPV-gie-rvfv-g（n+c）的IFA 鉴定
• 3.2.5 重组病毒rGPV-gie-rvfv-g（n+c）滴定与生长动态学测定结果
• 4. 讨论
• 4.1 表达绿色荧光蛋白的重组山羊痘病毒构建
• 4.2 裂谷热病毒糖蛋白在重组山羊痘病毒中表达与纯化
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文