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黑龙江省黄瓜霜霉病菌生理小种分化的研究

2020-11-30阅读(612)

黑龙江省黄瓜霜霉病菌生理小种分化的研究

论文摘要

由鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉科、古巴假霜霉菌[Pseudoperonospora cubensisi（Berk.EtCurt）Rost]侵染引起的黄瓜霜霉病,是黄瓜生产中发生最广、造成损失最严重的病害。由于黄瓜霜霉菌是一种活体营养专性寄生菌,无法人工培养,因而限制了对黄瓜霜霉菌生理分化、群体遗传等方面的深入研究。本试验尝试以ITS区序列分析方法,配合RAPD分析方法和传统的形态（孢子囊）差异分析及致病性差异分析方法,探究黑龙江省黄瓜霜霉病菌的生理小种分化问题,为黄瓜的抗病育种提供依据。研究结果如下:对其中的20个菌株致病性进行测定,结果显示不同菌株对同一寄主的致病性不同,证明其毒性存在明显的差异。根据20个菌株在9个鉴别寄主上的反应,可将其划分为5个致病性类型。分别为Ⅰ组:Pc-hb2、Pc-hb3、Pc-qq1、Pc-qq3、Pc-md1、Pc-dq2、Pc-da3、Pc-hh2、Pc-hh3、Pc-hh4、Pc-hh5,Ⅱ组:Pc-im1、Pc-dq1、Pc-hh1;Ⅲ组:Pc-hb1、Pc-qq2;Ⅳ组:Pc-hb6;Ⅴ组:Pc-hb4、Pc-hb5、Pc-hb7。采自同一城市的菌源毒性存在较大差异。病菌毒性和孢子囊大小及地理来源间无相关性。采用改良的CTAB法成功的提取了来自全省7个城市黄瓜霜霉病菌基因组DNA。并对的黄瓜霜霉病菌RAPD分子标记,结果说明,各菌株间相似性较低,各地由于栽培品种的不同,寄主与病原物之间强烈的相互选择,使黄瓜霜霉病菌这一专性寄生菌产生较为丰富的遗传多样性,存在较大的变异。其中菌株RAPD多态性与地理来源之间存在一定的相关性,多数来自同一城市的菌源间的亲缘关系较近。采自同一城市的菌源在形态、大小及亲缘关系上较为接近。通过筛选确定了黄瓜霜霉病菌ITS区扩增的优化体系,并采用此体系对31个黄瓜霜霉病菌株进行了扩增,均可得到约为900bp的片段。经序列测定和分析得知:菌株ITS区多态性与地理来源之间存在一定的相关性,多数来自同一城市的菌源间的亲缘关系较近:来自黑河的的菌株Pc-hh1和Pc-hh3与所有菌株遗传距离较远,这和其地理位置也有一定的关系:但不同城市菌源之间菌株ITS区多态性与地理来源的关系无规律性,即并非城市地理位置相距越近,其亲缘关系就越近;来自漠河的菌株Pc-mh1与其他菌株并无明显差异。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  • 1.1 研究的目的和意义
  • 1.2 黄瓜霜霉病的研究现状
  • 1.2.1 黄瓜霜霉病的发生历史和危害
  • 1.2.2 症状
  • 1.2.3 病原生物学特性
  • 1.2.4 病原菌生理分化
  • 1.2.5 病害流行规律
  • 1.3 病原真菌毒性变异及生理小种分化的研究
  • 1.3.1 病原真菌的毒性变异
  • 1.3.2 病原物生理小种的分化
  • 1.3.3 病原物生理小种鉴定方法
  • 1.4 主要研究内容和方法
  • 1.5 技术路线
  • 2 材料与方法
  • 2.1 孢子囊形态观察及大小测量
  • 2.1.1 供试菌源
  • 2.1.2 测定方法
  • 2.2 致病性测定
  • 2.2.1 植物材料
  • 2.2.2 供试菌源
  • 2.2.3 接种鉴定方法
  • 2.2.4 调查项目
  • 2.2.5 数据处理
  • 2.3 黄瓜霜霉病菌RAPD分析
  • 2.3.1 供试菌源
  • 2.3.2 DNA的提取与定量
  • 2.3.3 RAPD扩增
  • 2.3.4 引物筛选
  • 2.3.5 电泳检测扩增产物
  • 2.3.6 数据分析
  • 2.4 黄瓜霜霉病菌ITS区序列分析
  • 2.4.1 供试菌源
  • 2.4.2 引物筛选
  • 2.4.3 ITS反应程序及体系优化
  • 2.4.4 PCR扩增
  • 2.4.5 目的片段的回收
  • 2.4.6 目的片段与载体的连接
  • 2.4.7 连接产物转化大肠杆菌
  • 2.4.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 2.4.9 细菌中质粒DNA的制备
  • 2.4.10 重组质粒的筛选与鉴定
  • 2.4.11 重组克隆的测序和分析
  • 3 结果与分析
  • 3.1 孢子囊形态观察和大小测定结果
  • 3.2 致病性测定结果
  • 3.3 基因组提取方法
  • 3.5 体系优化
  • 3.5.1 引物筛选
  • 3.5.2 模板DNA浓度对ITS区扩增的影响
  • 2+浓度对ITS区扩增的影响'>3.5.3 Mg2+浓度对ITS区扩增的影响
  • 3.5.4 dNTP浓度浓度对ITS区扩增的影响
  • 3.5.5 TaqDNA聚合酶浓度对ITS区扩增的影响
  • 3.5.6 退火温度对ITS区扩增的影响
  • 3.5.7 31个黄瓜霜霉病菌株ITS区扩增结果
  • 3.6 ITS区序列分析
  • 4 讨论
  • 4.1 黄瓜霜霉病菌的致病性分化
  • 4.2 黄瓜霜霉病菌基因组DNA的提取方法
  • 4.3 RAPD分子标记的缺点
  • 4.4 ITS分析方法与黄瓜霜霉病研究
  • 4.5 关于试验中样本大小不一致的说明
  • 4.6 创新点与不足
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录A 英文缩略表
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

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