山羊精液液态保存过程中精子葡萄糖代谢的研究

论文摘要

精液保存技术可以使精子不受时间、地域和种畜自身限制,便于开展区域间协作,最大限度提高优良公畜的利用率,加速品种的育成和改良。精液长期保存的方法主要是冷冻保存,但是山羊精液冷冻会引起精子超微结构、生化和功能的损伤,应用冷冻保存的山羊精液输精时,情期受胎率一直比较低(50%左右),限制了该技术在生产中的应用。因此,人们正在探索山羊精液短期保存即液态保存,而这方面研究国内外报道很少,尤其是精子代谢机理的研究。保存过程中精子活力不同程度地下降,限制了保存后精子的应用,同时也限制了体外受精、人工授精等应用技术的推广。保存过程中精子存活时间和受精能力会受到许多因素的影响,例如离子成分、氧化应激、代谢性酸中毒、DNA断裂、精子质膜脂类和蛋白组分发生变化、顶体反应以及自发获能等,发现并消除这些不利因素,减少精液保存过程中精子受到的损伤,构建成分简单明确而又适宜精子体外存活的保存系统,将为精子代谢机理研究提供广阔空间。以成分明确而又简单的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)作为培养液,成功构建山羊精液液态保存系统,并在此基础上对液态保存过程中精子葡萄糖代谢机理进行了研究,以丰富“精子代谢机理”基础理论,为动物生产和医学临床提供理论依据。结果发现:1)无论是5℃还是15℃保存,无论是卵黄包被与否,稀释液添加钙镁离子均不利于精子存活,缩短精液保存时间。2)5℃条件下降温保存时,无论是卵黄包被与否,稀释液添加144mM葡萄糖离子均利于精子存活,延长精液保存时间。3)5℃条件下降温保存时,精液采用卵黄包被处理后再稀释后保存效果好,有利于精子存活。4)在不用卵黄包被而直接稀释条件下,与5℃、25℃相比,山羊精液以15℃保存效果最好,精子活力保持30%以上的保存时间能达到7d,成功建立起一个成分简单明确而又适宜精子体外存活的保存系统。5)15℃保存时,稀释液中添加3mM葡萄糖效果最好,精子活力保持30%以上的保存时间能达到9d。而葡萄糖浓度超过5mM/L时,保存效果反而不如不添加好,精子活力保持30%以上的保存时间仅为3d。6)15℃保存时,在含有葡萄糖的稀释液中添加碘醋酸酯(Iodoacetate)阻断精子糖酵解途径,能显著降低精子活力,缩短精液保存时间。7)15℃保存时,在含有葡萄糖的稀释液中添加脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone)阻断精子磷酸戊糖途径,对精液保存时间和山羊精子活力没有影响。8)15℃保存时,在不用卵黄包被条件下,与其它季节相比,冬季精液稀释后精子存活率低,差异显著;而采用卵黄包被而显著提高精子存活率。总之,通过本研究主要获得以下结论:1)稀释液中添加钙镁离子不利于山羊精子体外存活;2)5℃保存时添加葡萄糖有利于山羊精子活力维持;3)5℃保存时卵黄包被有利于山羊精子活力维持;4)不包被条件下,山羊精子适合在15℃保存;5)15℃保存时,PBS中添加3mM/L的葡萄糖保存效果最好,最有利于山羊精子存活,超过5mM/L不利于精子存活;6)山羊精液液态保存过程中,山羊精子活力维持和对葡萄糖的代谢利用依赖于糖酵解途径;7)山羊精液液态保存过程中,山羊精子活力维持和对葡萄糖的代谢利用不依赖于磷酸戊糖支路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 精液保存的方法和基本途径
• 1.2 精子结构
• 1.2.1 精子头部
• 1.2.2 颈部
• 1.2.3 精子尾巴
• 1.2.4 质膜
• 1.3 精子生理功能
• 1.3.1 精子运动能力产生机制
• 1.3.2 能量在尾巴的产生与穿梭
• 1.4 低温保存对精子产生的影响
• 1.4.1 对细胞骨架的影响
• 1.4.2 诱发精子获能、发生顶体反应
• 1.4.3 维持胚胎发育的能力降低
• 1.4.4 质膜特定脂质成分的丢失
• 1.4.5 能量代谢和pH 值改变
• 1.5 影响精子存活的因素
• 1.5.1 精浆对精子的影响
• 1.5.2 卵黄对精子的影响
• 1.5.3 离子物质对精子的影响
• 1.5.4 糖类物质对精子的影响
• 1.5.5 渗透压对精子的影响
• 1.5.6 自身老化产生的 ROS 对精子的影响
• 1.5.7 EDTA 对精子的影响
• 1.6 国内外山羊精液液态保存研究现状
• 1.7 精子能量代谢研究进展
• 1.7.1 精子能量代谢特点
• 1.7.2 不同阶段精子能量需求特征
• 1.7.3 细胞代谢利用葡萄糖、果糖的途径
• 1.7.4 葡萄糖和果糖单独存在时对精子代谢的影响
• 1.7.5 葡萄糖和果糖共同存在时对精子代谢的影响
• 1.7.6 精子可代谢利用的能量物质
• 1.7.7 精子代谢途径
• 1.8 精子功能状态检测方法
• 1.8.1 运动能力
• 1.8.2 精子活率
• 1.8.3 质膜完整性
• 1.8.4 线粒体膜电位
• 1.8.5 DNA 完整性
• 1.8.6 受精能力
• 1.9 本研究目的意义和主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验药品及主要液体的配方
• 2.2 试验地点及试验动物
• 2.3 精液的采集与稀释
• 2.4 精液分装与运输
• 2.5 精液的降温与保存
• 2.6 降温曲线绘制
• 2.7 保存精液的质量检测
• 2.8 实验设计
• 2.8.1 山羊精液体外保存系统优化与构建
• 2.8.1.1 5℃保存时影响山羊精子存活的因素
• 2.8.1.2 不同保存温度对精子存活率的影响
• 2.8.2 山羊精子葡萄糖代谢机理
• 2.8.2.1 添加不同浓度葡萄糖对山羊精子的影响
• 2.8.2.2 添加碘醋酸酯阻断葡萄糖糖酵解代谢途径对山羊精子的影响
• 2.8.2.3 添加脱氢表雄酮阻断葡萄糖磷酸戊糖途径对山羊精子的影响
• 2.9 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 山羊精液体外存活系统优化与构建
• 3.1.1 5℃保存时影响山羊精子存活的因素
• 3.1.2 不同保存温度对精子存活率的影响
• 3.2 山羊精子葡萄糖代谢机理实验结果
• 3.2.1 添加不同浓度葡萄糖对山羊精子的影响
• 3.2.2 添加碘醋酸酯阻断葡萄糖糖酵解代谢途径对山羊精子的影响
• 3.2.3 添加脱氢表雄酮阻断葡萄糖磷酸戊糖途径对山羊精子的影响
• 3.2.4 季节对山羊精子存活率的影响
• 3.2.5 冬季进行卵黄包被对山羊精子存活率的影响
• 3.2.6 卵黄包被条件下添加不同浓度葡萄糖对精子活力的影响
• 4 讨论
• 4.1 用PBS进行液态保存山羊精液系统建立的优越性
• 4.2 离子物质对精子功能的影响
• 4.3 多糖对保存过程中精子功能的影响
• 4.4 保存温度以及降温对精子的影响
• 4.5 卵黄对精子的影响
• 4.6 山羊精子代谢利用葡萄糖的能力
• 4.7 葡萄糖代谢在山羊精液液态保存过程中的作用
• 4.8 液态保存过程中山羊精子葡萄糖代谢的途径
• 4.9 不同季节以及处理方案对山羊精子活力的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 附录：图版及图版说明
• 致谢
• 作者简介
• 博士学位论文内容简介及自评