重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备及聚乙二醇修饰

论文摘要

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种抗肿瘤细胞因子,对各种肿瘤细胞有直接细胞毒作用,可激活机体的抗肿瘤免疫反应,引起肿瘤的缺血性坏死,其作为一种潜在的抗肿瘤药物的开发前景引起国内外的广泛重视。目前,其在国内外临床上有广泛的应用,常用于肝癌、宫颈癌的治疗,虽然其抗肿瘤的功能得到了充分的肯定,但是在使用过程中仍具有毒副作用、稳定性差、半衰期短等缺点。蛋白质PEG修饰技术在过去的近15年中得到了快速发展,已有多篇文献报道,蛋白质药物经PEG修饰后降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期,并用于临床治疗各种疾病。本文拟通过对肿瘤坏死因子-α衍生物的聚乙二醇修饰,获得低毒性、低免疫原性、高稳定性的肿瘤坏死因子-α。对天然TNF-α结构与功能关系的研究表明,适当改变其结构,可提高其杀伤肿瘤细胞的活性,降低其对组织器官的毒副作用。本研究应用搭桥PER技术,将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除,对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变,将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-αD4。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选获得了高效表达TNF-αD4突变体的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45%左右,经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90%以上的重组目蛋白,比活性达到8×107。在TNF-α的PEG修饰试验中,应用了三种不同分子量的单甲氧基聚乙二醇丁醛（mPEG-丁醛分子量分别为5k、10k、20k）对TNF-α衍生物TNF-αD4进行修饰。通过试验确定了最佳修饰条件,即反应pH6.0,TNF-αD4与mPEG-丁醛（5k）质量比1:2;TNF-αD4与mPEG-丁醛（10k）质量比1:4;TNF-αD4与mPEG-丁醛（20k）质量比1:8,反应时间16h为最佳反应条件。修饰产物经阳离子交换层析纯化得到了较纯的mPEG-TNF-αD4,纯度达85%以上。随后,对TNF-αD4聚乙二醇单一修饰产物的部分性质进行了研究,结果表明TNF-αD4及对其的聚乙二醇修饰达到了预期研究目标。mPEG-TNF-αD4（5k）的比活性达到8.6×107、mPEG-TNF-αD4（10k）比活性达到3.8×107、mPEG-TNF-αD4（20k）比活性达到7.5×106。与TNF-αD4相比,mPEG-TNF-αD4（5k）、mPEG-TNF-αD4（10k）、mPEG-TNF-αD4（20k）的免疫原性降低。此项工作通过应用PEG修饰肿瘤坏死因子-α衍生物,为降低其毒性,增加其活性进行了有益的尝试,为其进一步研究与开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、实验材料及方法
• （一）、实验材料
• （二）、实验方法
• 二、结果与分析
• （一）、tnf-α基因的扩增及表达载体的构建
• （二）、TNF-α D4的诱导表达
• （三）、蛋白的大量表达及纯化
• （四）、TNF-α D4的PEG修饰与纯化
• （五）、体外生物活性检测
• （六）、体内系统毒性检测
• （七）、免疫原性检测
• 三、讨论
• （一）、肿瘤坏死因子-α衍生物TNF-α D4的制备
• （二）、目的蛋白修饰产物的制备及纯化
• （三）、修饰产物体外活性和免疫原性
• 四、小结
• 参考文献
• 论文综述
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 发表的文章