鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究

论文摘要

血管紧张素转化酶在血压调节中具有双重的作用，它将无催化活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有活性的血管紧张素Ⅱ，同时，它还可催化降压物质舒缓激肽分解从而导致血压升高。食品蛋白质中存在着活性肽，其中对血管紧张素转化酶具有抑制作用的活性肽（降血压肽）的研究在国内外尤其引人注目，它可通过酶水解食品蛋白质而获得。采用鸡蛋蛋黄蛋白质为原料，经超临界CO2-乙醇萃取出蛋黄油和卵磷脂纯化蛋黄蛋白质，得到含量为74.68％的蛋黄蛋白质，蛋白质含量较传统的溶剂提取法提高了24％。经SDS—PAGE法测定，得蛋黄蛋白主要由35kDa、40kDa、67kDa和100kDa以上分子量的蛋白质组成。用12种蛋白酶酶解蛋黄蛋白质，结果显示所用酶水解产物对ACE皆具有抑制作用；采用体外保温抑制实验将其中活性较好的6种酶解产物进行筛选，确定了产物对ACE的抑制类型，并筛选出酶L为制备蛋黄降血压肽的酶类，其水解产物的IC50为1.19mg／mL。考察了各因素对酶解的影响，得到蛋黄蛋白质酶解作用最适水解时间为300min、温度为45℃、pH为9.5、底物浓度为60g／L、加酶量为0.42g／kg，此时蛋黄蛋白质水解度为17.2％，氮溶解指数为89.09％，平均肽链长度为6.5。建立了酶解蛋黄蛋白质的水解动力学模型，得到其动力学方程为r=（270.2E0-0.4125S0）exp[-0.23（DH）]，动力学模型与实验结果吻合较好。蛋黄水解液经活性炭脱色、采用截留分子量为10K和3.5K的超滤膜进行分离，所得蛋黄降血压肽超滤液对ACE抑制活性明显提高；用D61大孔阳离子交换树脂对分子量小于3.5kDa的水解液进行分离，确定了离子交换分离降血压肽的适宜条件为：采用pH4.1、浓度为0.05 mol／L的乙酸钠缓冲溶液+1.0mol／L的NaCl溶液，梯度洗脱，上样量为25mg／mL（湿树脂体积），洗脱速度为0.5mL／min，在此条件下，肽的得率与活性回收率分别为67.2％和73.59％。用Sephadex G-15对离子交换树脂分离出的穿透峰和洗脱峰分别进行分离和纯化，用RP-HPLC分离纯化最大活性组分峰，用RP-HPLC和高效毛细管电泳（HPCE）进行纯度鉴定，经薄层色谱分析和电喷雾质谱鉴定表征了降血压肽EY-1的结构序列为Leu-Tyr-Pro。蛋黄水解液的功能研究实验表明，蛋黄水解液有较好的耐热、耐酸稳定性，并发现不同分子量范围的水解产物具有较好的抗油脂氧化性能。与肠道酶作用结果表明，蛋黄水解液与胃蛋白酶作用后其IC50值由1.19mg／mL变为0.94mg／mL，与胰蛋白酶作用后产物的IC50则增至3.19mg／mL，活性有一定的损失，并经毛细管电泳肽谱图得到证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 简述
• 1.1.1 活性肽的概念与分类
• 1.1.2 生物活性肽吸收机制的研究
• 1.1.3 生物活性肽的作用与功能
• 1.1.4 生物活性肽的生产方法
• 1.2 高血压的产生及血管紧张素酶在血压调节过程中的控制机制
• 1.2.1 高血压的产生及分类
• 1.2.2 血管紧张素酶在血压调解过程中的控制机制
• 1.3 血管紧张素酶抑制剂的作用
• 1.3.1 天然血管紧张素酶抑制剂
• 1.3.2 合成血管紧张素酶抑制剂
• 1.3.3 降血压肽结构与功能的关系
• 1.4 食品降血压肽的研究进展
• 1.4.1 国外食品降血压肽研究进展
• 1.4.2 国内食品降血压肽研究进展
• 1.4.3 食品降血压肽的生产方法
• 1.4.4 食品降血压肽的应用前景及展望
• 1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容
• 1.5.1 研究的目的
• 1.5.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 血管紧张素转化酶抑制剂分析方法的选择
• 2.1 前言
• 2.2 血管紧张素转化酶体外活性测定原理
• 2.3 实验药品及仪器
• 2.3.1 实验药品
• 2.3.2 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 Hip和HHL特征波长的确定
• 2.4.2 采用HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法
• 2.4.3 马尿酸（Hip）的回收率测定
• 2.5 实验结果及讨论
• 2.5.1 Hip和HHL特征波长
• 2.5.2 马尿酸的浓度和峰值的关系
• 2.5.3 HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法
• 2.5.4 马尿酸的回收率
• 50的标定'>2.5.5 Captopril IC₅₀的标定
• 2.5.6 Captopril抑制ACE酶的类型
• 2.6 本章小结
• 参考文献
• 第三章 蛋黄蛋白质的制备与蛋黄降血压肽的酶系筛选
• 3.1 前言
• 3.2 实验药品及仪器
• 3.2.1 实验药品
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 原料及产物分析方法
• 3.3.2 蛋白质酶解实验及酶系筛选
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 蛋黄蛋白质提取物主要成分分析
• 3.4.2 蛋黄蛋白质氨基酸分析
• 3.4.3 蛋黄蛋白质分子量的测定
• 3.4.4 蛋黄蛋白质的酶法水解物对ACE的体外抑制活性效果
• 3.4.5 蛋黄酶解物对ACE保温稳定性分析及酶系筛选
• 3.5 本章小节
• 参考文献
• 第四章 蛋黄降血压肽酶解工艺条件优化及动力学研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与设备
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 实验原料及药品
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 蛋黄蛋白质的酶法水解
• 4.3.2 水解度测定
• 4.3.3 酶解产物对ACE体外抑制活性的测定
• 4.3.4 蛋黄降血压肽平均肽链长度的计算方法
• 4.3.5 蛋黄蛋白质酶解液氮溶解指数的测定
• 4.4 酶解动力学研究
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 不同时间下水解度（DH）变化及水解度和产物对ACE抑制效果随时间的变化
• 4.5.2 肽链长度和ACE抑制效果随水解度的变化
• 4.5.3 水解度和氮溶解指数随时间的变化
• 4.5.4 加酶量对水解度的影响
• 4.5.5 pH对水解度的影响
• 4.5.6 温度对水解度的影响
• 4.5.7 底物浓度对水解度的影响
• 4.6 酶解动力学研究
• 4.6.1 酶促动力学方程
• 4.6.2 酶促动力学模型的参数的确定
• 4.6.3 蛋白酶失活的常数确定
• 4.6.4 可控酶解的动力学模型验证
• 4.7 本章小节
• 参考文献
• 第五章 蛋黄降血压肽的分离纯化与结构表征
• 5.1 前言
• 5.2 实验药品和设备
• 5.2.1 实验材料和药品
• 5.2.2 主要设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 蛋黄降血压肽的脱色
• 5.3.2 蛋白质浓度的测定方法
• 5.3.3 蛋黄降血压肽的超滤
• 5.3.4 离子交换纯化蛋黄降血压肽
• 5.3.5 Sephadex G-15纯化蛋黄降血压肽
• 5.3.6 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽
• 5.3.7 高效毛细管电泳鉴定EY-1的纯度
• 5.3.8 EY-1的氨基酸分析
• 5.3.9 MS测定EY-1的序列
• 5.4 结果和讨论
• 5.4.1 脱色对蛋黄降血压肽活性的影响
• 5.4.2 超滤分离蛋黄降血压肽
• 5.4.3 离子交换纯化蛋黄降血压肽
• 5.4.4 Sephadex G-15纯化蛋黄降血缸压肽
• 5.4.5 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽
• 5.4.6 高效毛细管电泳检验EY-1纯度
• 5.4.7 EY-1的氨基酸分析
• 5.4.8 MS测定EY-1序列
• 5.5 本章小节
• 参考文献
• 第六章 蛋黄降血压肽的功能性质研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验仪器和设备
• 6.2.1 主要仪器
• 6.2.2 实验材料和药品
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 蛋黄降血压肽的热稳定性研究
• 6.3.2 蛋黄降血压肽的酸稳定性研究
• 6.3.3 蛋黄降血压肽的体外消化道实验研究
• 6.3.4 蛋黄降皿压肽抗肠胃道酶降解的高效毛细管电泳肽谱图
• 6.3.5 蛋黄降血压肽抗氧化活性的研究
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 加热时间对蛋黄降血压肽活性的影响
• 6.4.2 不同pH对蛋黄降血压肽活性的影响
• 6.4.3 蛋黄降血压肽抗肠胃道酶降解及其高效毛细管电泳肽谱图分析
• 6.4.4 不同分子量蛋黄水解物抗氧化活性的研究
• 6.5 本章小节
• 参考文献
• 结论与展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章