RNAi抑制口蹄疫病毒复制与感染的相关研究

论文摘要

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是20世纪90年代末发现的一种真核生物细胞在转录后引发基因沉默的分子机制，该机制的发现被美国Science杂志评为2001年世界十大科技进展之首，是近年来分子生物学最引人关注的研究进展。诱发RNAi的最关键分子是长度为19—27个核苷酸的双链RNA，称作小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），并由一系列蛋白复合物介导，对与之具有序列同源性的基因在转录、转录后、翻译等水平进行表达调控。SiRNA可以由细胞内源性产生，或者外源性由病毒感染、转座子侵入、或质粒转染表达。该机制在从酵母到哺乳动物等真核生物中普遍保守，并证明在这些物种中发挥着发育调控、病毒免疫等重要功能。目前，RNAi的分子机制及其功能仍然有待更加细致地阐明，但作为一种反向遗传学手段已经在基因功能研究中广泛运用，并已作为一种治疗策略运用于人类抵抗重大遗传性疾病和病毒性疾病的研究当中。本文将对RNAi的分子机制，及其抗病毒功能的相关研究作出简要的概括和展望。口蹄疫（foot-and-mouth diseas，FMD）是偶蹄类动物的高度传染性疾病，引发FMD的病原体是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒（FMD virus，FMDV）。VP1基因是FMDV的四个结构蛋白基因之一，在病毒感染过程中该蛋白与易感细胞表面受体结合，介导病毒对细胞的感染。我们设计并构建了两个靶向FMDV VP1基因的shRNA表达质粒（pNT21和pNT63），首先在BHK-21细胞中评估了该shRNA表达质粒对VP1／绿色荧光蛋白（EGFP）融合报告基因表达的抑制效应，接着在BHK-21细胞和乳鼠动物模型中进一步检验了它们的抗病毒活性。结果表明，当shRNA表达质粒与报告基因表达质粒（pVP-EGFP-N1）共转染BHK-21细胞时，报告基因的表达水平降低了80-90％。在病毒攻击实验中，转染了shRNA表达质粒的8HK-21细胞能够显著抵抗100个半数细胞感染剂量(50％tissue culture infective dose，TCID50)FMDV的感染，抗病毒效应持续时间超过48小时。在乳鼠动物模型中，用100微克shRNA表达质粒通过颈部皮下注射乳鼠，约80％的动物在6个小时后能够抵抗20个半数动物致死剂量(50％animal lethal dose，LD50)FMDV的攻击。此外，我们发现了一种增强RNAi效应的新途径，我们构建了一个表达VP1基因mRNA的质粒pVP1，将该质粒与shRNA表达质粒共同注射乳鼠可以显著提高动物的保护率。实验结果暗示，RNAi可能成为预防或治疗FMDV感染的可行方法。发展RNAi技术使其成为一种可行的FMDV防御策略面临一个重大的挑战，那就是RNA病毒普遍具有的高度的遗传多变性。这里，我们通过序列分析确定了FMDVHKN／2002基因组的5个保守区（分别是5’NCR、VP4、VPg、POL和3’NCR），并采用T7 RNA聚合酶体外转录长dsRNA、人重组Dicer酶体外剪切的策略获得鸡尾酒siRNA（cocktail siRNA）。实验结果表明，这些siRNA的转染能够有效降低相应的保守区基因与EGFP融合基因在BHK-21细胞中的表达水平。在病毒攻击实验中，能够诱导BHK-21细胞对O型同源（HKN／2002）和异源（CHA／99）毒株的交叉抑制，在病毒感染48 h检测到约10-1000倍的抑制效率，而且，抑制效应至少持续了6天。有趣的是，这些HKN／2002特异性的siRNA还能够显著抵抗Asial型病毒YNBS／58的感染，在感染后12、24和48 h均检测到了约10倍的抑制效率，但是该抑制效应最多只能持续约60 h。此外，我们观察到在事先感染了FMDV的BHK-21细胞中，siRNA的转染对病毒复制的抑制似乎更加有效。我们的实验结果表明，靶向病毒基因组保守区的RNAi是克服病毒遗传多变性的一种可行的策略。业已证明RNAi作为FMDV防御策略在细胞水平是有效的，但是在动物个体水平的有效性仍然有待评估。在这里，我们采用复制缺陷型的人重组腺病毒（Ad5）作为载体构建能够表达靶向FMDV 1D和3D基因shRNA的新型重组腺病毒（分别为Ad5-NT21和Ad5-POL）。实验证明，Ad5-NT21和Ad5-POL能够完全保护猪IBRS-2细胞不受同源FMDV毒株的感染，Ad5-POL还能够抵抗异源FMDV毒株的感染。接着我们利用豚鼠作为动物模型，评估了新型重组腺病毒在动物个体内对FMDV感染的抑制效应，结果表明，每头豚鼠肌肉注射106PFU剂量Ad5-POL，在面对24 h后50 ID50同源FMDV攻击时，有3／5的动物没有明显的口蹄疫疾病症状（即在脚掌发生病毒性水泡）；但是，两次免疫、或者提高重组腺病毒的剂量、或者同剂量Ad5-NT21／Ad5-POL混和注射等对免疫方法简单地进行改进并不能提高对动物的保护效率；令人惊讶的是，Ad5-NT21／Ad5-POL的混和注射使豚鼠能够即刻有效地抵抗50 ID50同源FMDV攻击，这暗示腺病毒介导的RNAi能够十分快速地抑制病毒的复制。以豚鼠动物模型的抗病毒实验数据为参照，我们进一步以易感动物而且也是主要的经济型动物之一的家猪作为对象，评估了重组腺病毒的抗病毒潜力，结果显示，给家猪颈部肌肉注射4×109 PFU剂量Ad5-NT21／Ad5-POL混合腺病毒，有2／3的猪能够抵抗24 h后100 ID50同源FMDV的攻击而不发生任何明显的口蹄疫疾病症状。Ad5-NT21和Ad5-POL的抗病毒潜力是特异的，因为作为对照的能够表达靶向大肠杆菌LacZ基因shRNA的重组腺病毒Ad5-LacZ没有任何显著的抗病毒活性。绝大多数真核生物细胞拥有一套由dsRNA诱发的对具有序列同源性的mRNA产生表达抑制效应的分子机制，称为RNA沉默（RNA silencing）。大量的研究资料表明，RNA沉默是植物和无脊椎动物细胞主要的病毒防御机制。近年来发现，该分子机制也十分保守地存在于哺乳动物细胞当中，尽管哺乳动物细胞诱发的RNA沉默反应的能力似乎比植物或无脊椎动物细胞有所减弱。由于脊椎动物具备一套完善的蛋白质水平的免疫系统（protein-based immune system），因此，在脊椎动物细胞中发现RNA沉默分子机制使科学界对脊椎动物病毒防御机制的发展进化有了更新的认识。我们认为，脊椎动物拥有的另一套病毒防御机制——干扰素系统（IFN system）可能是真核生物免疫系统从RNA沉默进化到蛋白质免疫过程当中的中间产物：干扰素系统的出现可能解释了RNA沉默机制在脊椎动物细胞中的弱化以及蛋白质免疫系统的发展与成熟。此外，我们在本文中亦强调，RNA沉默机制的发现为人类更深地了解脊椎动物病毒防御机制乃至生命进化提供一个契机。

论文目录

• 主要英文缩写列表
• 第一部分 综述
• RNA干扰的分子机制、功能及其作为病毒防御策略的研究进展
• 摘要
• Abstract
• 前言
• RNAi分子机理
• MicroRNA与RNAi
• RNAi介导的细胞发育调控
• RNAi与病毒防御
• 展望
• 参考文献
• 第二部分 研究论文
• 第一章 靶向VP1基因的RNAi抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞和乳鼠中的复制与感染
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 靶向FMDV基因组保守区的RNAi诱导对异源毒株感染的交叉抑制
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 腺病毒介导的RNAi抑制FMDV在IBRS-2细胞、豚鼠以及猪体内的复制与感染
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 理论假设
• RNA沉默机制与脊椎动物蛋白质水平免疫系统之间的进化关系
• 摘要
• Abstract
• 前言
• RNAi是天然的病毒防御机制
• 脊椎动物RNAi可能与蛋白质免疫系统协同作用
• 干扰素反应:RNA沉默与蛋白质免疫系统之间的进化纽带?
• 展望
• 参考文献
• 总结
• 综述部分
• 研究部分
• 理论假设部分
• 发表论文
• 申请专利
• 获得荣誉、奖项、及科研基金
• 致谢