水稻GAL4/UAS异位表达系统的建立和花模式形成基因SFL的功能分析

论文摘要

把转基因的表达限制在特定的时空区域不仅是研究者们操纵转基因的主要目标之一，也是更为精确可靠地揭示基因功能的研究思路。GAL4／UAS双因子异位表达技术体系就是控制基因在特定时空特异表达技术的一种并用于揭示基因的潜在功能。该系统由两类转基因株系构成，一类是模式系（或称作驱动系），它是由增强子诱捕载体转化植物所得，这类株系的报告基因时空表达模式代表了驱动蛋白GAL4-VP16（转录因子）的表达模式，故筛选报告基因时空特异表达的株系为限制转基因的时空性表达提供必备条件。另一类是目标系（或称效应系），它是由目标载体携带目标基因转化与模式系有相同遗传背景的植物而来，目标基因就是需要时空限制表达的基因，由只对GAL4-VP16起响应的启动子UAS所控制，因而在没有GAL4-VP16蛋白存在时，目标系中的目标基因是沉默的。而在模式系与目标系的杂种后代中，目标基因被组织特异性的GAL4-VP16所驱动而呈现组织特异表达。本研究主要内容是在水稻中建立GAL4／UAS双因子异位表达技术平台并利用该技术重点鉴定一些转录因子基因的功能。主要结果如下：1．用增强子诱捕载体pSMR-J18R转化水稻品种中花11，在潮霉素抗性愈伤阶段，筛选GUS不表达的愈伤，并分化为成熟单株，筛选表型正常的株系，鉴定整个生育期GUS报告基因的表达模式，筛选到5个组织特异性表达（P1，花药；P2，柱头；P3，花药；P4，内外稃；P6，叶片和雄蕊）和一个组成型表达的模式系（P7，在所有检测的组织中表达）。2．构建通用目标载体pGOFS1和pGOC17。其中，目标载体pGOC17可以利用同源重组方法高效装载外源基因。3．在pGOFS1载体基础上，构建目标基因载体23个，其中转录因子载体20个，非转录因子载体3个。将这些载体导入农杆菌中，转化水稻中花11产生各个目标基因的转基因家系。此外，pGOFS1空载体的转基因家系则形成ER（EGFP-reporter）报告基因株系。4．利用Southern杂交，鉴定了13个T0代目标基因家系的插入拷贝数，以及六个模式系的转基因插入拷贝数。并筛选2到5个表型正常的单拷贝插入目标系用于与模式系杂交。5．共选择出14个目标系做母本，与6个模式系父本进行杂交，共计获得50个杂交组合的杂种。6．在ER株系与各模式系的杂交后代，发现GFP可以被各模式系中的GAL4-VP16所激活，并和GAL4-VP16的表达模式类似。7．在杂交F1代，出现显性表型。这些表型包括苗期致死，延迟生长，分蘖数减少，叶片变窄，叶片角度增大，抽穗延迟，花粉不育，雌蕊增多等表型。并发现突变表型的出现与GFP和GUS共发生。8．证实了杂种P7／T11中表型的改变，如叶片下垂，叶片变窄，分蘖数减少等是由于目标基因被反式激活的缘故。9．详细鉴定了其中一个功能获得性突变体SFL（Seaflower），该突变体是由P3模式系（花药特异表达）与T10目标系（目标基因编码MYB同源蛋白）杂交所得，呈现出多子房结构。10．通过扫面电镜和解剖学观察发现，这些增多的子房是由雄性器官同源转换过来。11．通过表达分析发现许多控制雌性器官的基因出现上升表达，如C类基因OsMADS3，OsMADS58，DL（Drooping Leaf），D类基因OsMADS13等。12．原位杂交显示在第三轮花器官，出现DL的异位表达，说明SFL在雄蕊的激活表达引起DL的活性。同时发现，另一C类基因OsMADS3在花器官出现了增强和延伸表达。13．SFL在雄蕊的异位表达不仅引起多雌蕊结构发生，还诱发肿瘤样结构发生。通过原位杂交显示这些肿瘤样结构具备胚珠细胞特征。虽然SFL在花器官的表达引起了细胞增生，而在其他器官如成熟的叶片中表达则导致细胞死亡。显示SFL调控细胞的增生或凋亡具有细胞类型特异性。14．SFL属于细胞非自主性蛋白，可以在细胞之间移动，因而，有时在其他花器官中也建立了新的心皮结构，如在浆片和内稃的边缘等区域。而自身的第四轮花器官则被诱导细胞增生。15．水稻的外稃则没有受到影响，且只有内稃的膜状结构被诱导成柱头状结构，结合水稻的其他相关突变体分析，可以初步认为水稻的内稃膜状边缘结构相当于拟南芥的花萼结构。16．原位杂交结果显示SFL主要限制在花分生组织表达。17．共产生RNAi及antisense植株85株，并从中鉴定出SFL下降表达植株共4株。但这些植株均表现正常，暗示SFL可能属于一个功能冗余基因。结论：本研究在水稻中已成功地建立了GAL4／UAS双因子异位表达技术平台并用于鉴定和发掘基因的功能。在该系统的基础上，转录因子SFL功能得到鉴定。作者发现SFL在花器官中异位表达后能激活雌蕊特征基因DL的表达，从而导致花器官的同源异型转换，而在其他成熟器官中异位表达则导致细胞死亡，显示SFL在水稻花器官发育中的特异性调控功能。

论文目录

• 缩写名词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 植物功能基因组学
• 1.2 植物功能基因组学研究的主要方法和技术
• 1.2.1 基因表达谱分析技术
• 1.2.2 以转座子或T-DNA介导的基因标签（gene tagging）技术
• 1.2.2.1 激活标签（activation tagging）
• 1.2.2.2 启动子或增强子诱捕技术（gene trapping）
• 1.2.3 基因功能丧失技术
• 1.2.3.1 基因打靶技术
• 1.2.3.2 基因沉默—反义RNA,核酶与RNA干涉技术（RNAi）
• 1.2.3.3 显性负突变策略（dominant-negative approach）
• 1.2.4 基因功能增强技术
• 1.3 双因子反式激活体系介导的基因异位表达
• 1.3.1 双因子反式激活系统的作用机理
• 1.3.2 双因子反式激活系统在动物功能基因组研究中的应用
• 1.3.2.1 目标基因异位表达导致功能获得性新表型的出现
• 1.3.2.2 目标基因异位表达导致功能丧失表型
• 1.3.2.3 GAL4/UAS系统在大规模功能获得性突变体筛选中的应用
• 1.3.2.4 GAL4/UAS异位表达系统在基因功能解析中的应用
• 1.3.3 双因子反式激活系统在植物功能基因组研究中的应用
• 1.3.3.1 LHG4/pOp系统在植物功能基因组中的应用
• 1.3.3.2 GAL4/UAS系统在植物功能基因组中的应用
• 1.4 驱动系和目标系的建立
• 1.4.1 驱动系的构建
• 1.4.2 目标基因
• 1.4.2.1 转录因子
• 1.4.2.2 转录因子作为目标基因的优越性
• 1.5 本研究的目的及创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 载体构建
• 2.1.1 模式系和目标系载体的构建
• 2.1.2 其它载体的构建
• 2.1.2.1 pGOC17-shp7目标载体
• 2.1.2.2 酵母单杂交融合载体构建
• 2.1.2.3 原位杂交载体及亚细胞定位载体的构建
• 2.1.2.4 SFL抑制载体
• 2.2 目标系的产生和鉴定
• 2.3 模式系的筛选
• 2.4 农杆菌介导的瞬时表达
• 2.5 遗传杂交和表型鉴定
• 1代植株报告基因表达的检测'>2.6 杂交F₁代植株报告基因表达的检测
• 2.7 目标基因的Northern杂交分析
• 2.8 RT-PCR和Real-time PCR分析
• 2.9 Yeast one-hybrid分析
• 2.10 SEM和组织解剖分析
• 2.11 组织原位杂交和亚细胞定位
• 3 结果与分析
• 3.1 模式系和目标系载体
• 3.2 异位表达系统的瞬时表达验证
• 3.3 模式系和目标系的产生
• 3.3.1 模式系的产生
• 3.3.2 目标系及其拷贝数的鉴定
• 3.4 遗传杂交及杂种中的GFP报告基因检测
• 3.5 GFP和目标基因共表达
• 3.6 部分转录因子异位表达导致表型变化
• 3.7 T10目标基因的异位表达和功能分析
• 3.7.1 SFL突变体的鉴定
• 3.7.2 SFL突变体的形态发生
• 3.7.3 多心皮器官的功能
• 3.7.4 C类和D类基因的增强表达
• 3.7.5 SFL的体内表达
• 3.7.6 SFL直接激活DL和OsMADS3,而非OsMADS13
• 3.7.7 SFL的亚细胞定位及其它表型
• 3.7.8 SFLknock-down表型
• 4 讨论
• 4.1 GAL4/UAS双因子异位表达平台的建立
• 4.2 双因子异位表达系统的优化
• 4.2.1 时空双重控制
• 4.2.2 模式系载体及目标载体的优化
• 4.3 如何大规模建立目标系
• 4.4 利用异位表达系统鉴定基因的功能
• 4.5 组织特异性基因沉默
• 4.6 OsMADS15功能验证
• 4.7 SFL与水稻花器官发育
• 4.7.1 水稻的花器官发育相关基因
• 4.7.1.1 ABC模型及其更新
• 4.7.1.2 水稻花器官特征基因
• 4.7.2 SFL调控心皮发育
• 4.7.3 SFL调控细胞增殖
• 4.7.4 SFL的细胞非自主性与其它花器官的同源转换
• 4.7.5 雌雄嵌合体及不完全转换
• 4.7.6 SFL雌雄器官不育
• 4.7.7 水稻花发育的ABC三类基因
• 5 总结和展望
• PROTOCOLS
• 参考文献
• 附录
• 致谢