论文摘要
毕赤酵母是现在广泛应用的、重要的外源基因表达宿主。本研究是我室毕赤酵母工程菌糖基化改造系列工作的必要组成部分。β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ（beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase Ⅰ,GnTⅠ）是哺乳动物细胞糖蛋白N-糖链加工的关键酶之一,催化糖链由甘露糖型向杂合型转变。本研究将人的gnt1基因引入毕赤酵母宿主细胞,以期获得GnT1在宿主细胞内的表达,使酵母宿主细胞具有合成杂合型糖链的能力。 首先用PCR方法调取人gnt1编码区DNA片段,用编码酿酒酵母MNN9高尔基体定位信号的114bp DNA序列替换人GnTⅠ原有的高尔基体定位信号的编码序列,并在gnt1编码区的下游连接Myc表达标签的编码序列。将该DNA嵌合片段mnn9-gnt1-myc克隆至毕赤酵母表达载体pAO815,使其受控于表达载体醇氧化酶（AOX）启动子,得到毕赤酵母表达载体pAO815-mnn9-gnt1-myc（简称pAgm）,转化毕赤酵母GS115菌株,得到转化子GS115-pAgm。 以荧光物质氨基萘磺酸（ANTS）标记的甘露五糖（Man5GlcNAc2）和UDP-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）为底物,检测转化子GS115-pAgm破菌上清液中GnTⅠ的活性,反应产物进行荧光辅助糖电泳（Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis,FACE）分析。电泳结果显示,经转化子GS115-pAgm破菌上清液作用的Man5GlcNAc2（ANTS）在PAGE电场的迁移速率变慢,表明反应后的寡糖分子量增大,变化量约为一个乙酰葡萄糖胺基团,显示已完成乙酰葡萄糖胺基团的加合,证明GS115-pAgm转化子破菌上清液具有乙酰葡萄糖胺转移酶活性。
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标签：乙酰葡萄糖胺转移酶论文; 毕赤酵母论文; 荧光辅助糖电泳论文;