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胸膜肺炎放线杆菌菌影（Ghost）的制备及其免疫效力评价

2020-11-30阅读(760)

胸膜肺炎放线杆菌菌影（Ghost）的制备及其免疫效力评价

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。自1957年Pattison首次报道本病以来,在世界范围内广泛流行,并给各国养猪业带来了严重的经济损失。目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病,但由于APP血清型较多,灭活疫苗对不同血清型APP的交叉保护效果十分有限,因此开发新型疫苗已经成为研究热点。本实验通过PCR技术扩增噬菌体PhiX174的溶菌基因E,将该基因连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使溶菌基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的溶菌盒E-λPL/PR-cI857,构建重组质粒pBV-E。再将含有E基因的溶菌盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中,成功地构建App-E.coli穿梭溶菌质粒pGZRS-Eλ。采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌APP1型shope 4074菌株中,含有裂解质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28oC条件下生长到对数生长期,然后添加氯霉素至终浓度1μg/ml,升温到42oC诱导其溶解,制成了胸膜肺炎放线杆菌菌影。电镜观察菌影细胞形态完整保持了细菌的基本细胞形态,内容物全部被释放到胞外,细胞表面发生明显的皱缩。本实验构建的溶菌质粒pBV-E和pGZRS-Eλ在各自宿主菌中的溶菌效率分别达到了99.86%和99.99%。本实验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂形式奠定了基础。将胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗以5×109cfu/只的剂量分两种方式对实验猪进行免疫:实验Ⅰ组（肌肉注射免疫组）、实验Ⅱ组（滴鼻免疫组）和对照组,实验组每组6只,对照组4只。进行猪的免疫攻毒保护实验。免疫共分2次,每次间隔两周。第2次免疫后第14d,分别以APP1型菌（5×109cfu）和APP2型菌（5×109cfu）进行攻毒。以APP1全菌体为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明,1免1周后肌肉注射APP Ghosts免疫后猪血清抗体水平明显上升,与滴鼻免疫组和对照组相比差异显著（p < 0.05）。1免2周抗体水平略有下降,2免1周后抗体水平明显上升。2免2周后肌肉注射免疫组抗体水平略有上升,与滴鼻免疫组和对照组相比差异极显著（p < 0.01）。而滴鼻免疫组与对照组的差异始终不显著（p > 0.05）。攻毒2周后,根据攻毒后猪的存活率、肺脏病理变化及间接免疫荧光检测,综合评价胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗的免疫保护效果。结果表明,通过肌肉注射胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗可以激发动物体内产生较好的免疫应答,并明显优于滴鼻免疫组。本研究制备的胸膜肺炎放线杆菌菌影具有良好的应用前景,为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  • 1.1 猪传染性胸膜肺炎的流行与危害
  • 1.1.1 病原学
  • 1.1.2 流行病学
  • 1.1.3 临床症状和病理变化
  • 1.1.4 实验室诊断方法
  • 1.1.5 预防
  • 1.2 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展
  • 1.2.1 灭活疫苗
  • 1.2.2 弱毒活疫苗
  • 1.2.3 亚单位疫苗
  • 1.2.4 Ghosts 疫苗
  • 1.3 研究目的及意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 质粒与菌株
  • 2.1.2 实验动物
  • 2.1.3 主要试剂
  • 2.1.4 主要仪器设备
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 DH5α“Bacterial Ghost”的制备
  • 2.2.2 胸膜肺炎放线杆菌菌影的制备
  • 2.2.3 胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗的制备
  • 2.2.4 猪的免疫及攻毒
  • 2.2.5 血清特异性抗体的检测
  • 2.2.6 攻毒后猪肺脏病理变化
  • 2.2.7 间接免疫荧光进行肺脏的抗原定位试验
  • 2.2.8 数据处理
  • 3 结果与分析
  • 3.1 目的基因的克隆与序列测定结果
  • 3.1.1 裂解基因E 的PCR 扩增
  • 3.1.2 重组质粒pMD18-E 和溶菌质粒pBV-E 的鉴定
  • L/PR-c1857）的扩增'>3.1.3 溶解盒基因（E-λPL/PR-c1857）的扩增
  • 3.1.4 穿梭溶菌质粒pGZRS-Eλ的PCR 鉴定
  • 3.2 APPE 的PCR 鉴定结果
  • 3.3 溶菌质粒溶菌的最佳条件
  • 600nm值和诱导时间对细菌裂解率的影响'>3.3.1 菌液OD600nm值和诱导时间对细菌裂解率的影响
  • 3.3.2 氯霉素对宿主菌的影响
  • 3.4 诱导后的细菌生长曲线
  • 3.5 裂解率计算的结果
  • 3.5.1 大肠杆菌工程菌株DH5α的裂解率
  • 3.5.2 胸膜肺炎放线杆菌的裂解率
  • 3.6 电镜观察结果
  • 3.6.1 大肠杆菌菌影的电镜观察结果
  • 3.6.2 胸膜肺炎放线杆菌菌影的电镜观察结果
  • 3.7 猪血清特异性抗体的动态变化
  • 3.8 猪攻毒后的保护情况
  • 3.8.1 猪攻毒后的保护情况
  • 3.8.2 猪攻毒后的体温检测
  • 3.8.3 猪攻毒后的病理解剖学变化
  • 3.8.4 猪攻毒后肺脏组织学病变
  • 3.8.5 猪攻毒后肺脏间接免疫荧光结果
  • 4 讨论
  • 4.1 溶菌质粒在氯霉素作用下的溶菌情况
  • 4.2 诱导前菌液浓度对细菌裂解的影响
  • 4.3 胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗刺激猪体内产生的抗体水平
  • 4.4 胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗对猪的保护作用
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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