癫痫发病的分子机制研究

论文摘要

第一部分戊四氮致痫大鼠海马CA3区钙超载与癫痫发病机制的相关性研究目的探讨海马CA3区钙超载在癫痫发病中的作用及尼莫地平对海马CA1、CA3区钙超载的拮抗作用。方法实验SD大鼠26只。随机分为两组:第一组19只,为钙超载检测组,第二组7只,为组织病理学检查组。（1）用戊四氮（PTZ）（60mg/kg）诱发急性癫痫发作模型,将致痫成功的大鼠麻醉后制作海马脑片,在人工脑脊液（ACSF）的孵育下用荧光倒置显微镜测定癫痫状态下海马CA1、CA3区钙超载的情况,并用钙通道拮抗剂尼莫地平作用于海马脑片观察钙超载的变化。并与正常对照组相比较。（2）将致痫成功的大鼠麻醉后做成海马脑片,观察海马的组织病理学的改变,并在高倍镜下（40×10）计数海马CA1、CA3、CA4区的神经元的丢失。结果癫痫大鼠海马CA1、CA3区细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）高于对照组,CA3区[Ca2+]i高于CA1区,在尼莫地平的作用下CA3区[Ca2+]i明显降低。组织病理学改变亦显示CA3区是海马区神经元变性、坏死是最明显的部位。海马皮质神经元损伤的轻重程度依次为CA3>CA4>CA2>CA1。海马CA3区的神经元丢失最为明显,明显多于CA1区,与上述钙超载的研究结果相符。结论钙超载参与了癫痫的发病机制,其中海马CA3区的钙超载在癫痫发病机制中起主要作用。尼莫地平能通过减轻癫痫状态下的钙超载而对癫痫有辅助的治疗作用。第二部分戊四氮诱导大鼠癫痫发作的mGLuR1表达与神经元凋亡目的探讨癫痫发作后mGLuR1α的表达及与神经无凋亡的关系,研究mGLuRlα在癫痫活动中的作用。方法实验SD大鼠36只,随机分为对照组和致痫组,致痫组又分为致痫后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h组,每组6只.用免疫组织化学和RT-PCR的方法检测戊四氮诱导大鼠癫痫发作脑神经细胞不同时间点的mGLuR1a表达变化;采用原位末端标记法和流式细胞仪检测其神经元凋亡。结果（1）TUNEL染色阳性的神经元在致痫后6 h开始表达,12 h最明显,此后逐渐下降, 72 h时仍有表达。对照组和致痫组的细胞凋亡率也显示在致痫后12 h时细胞凋亡率最高,以后随时间的延长逐渐下降。（2）mGLuR1αmRNA转录水平在致痫后6 h达到最高水平,12 h时仍处于较高水平,以后逐渐降低,72 h时仍高于正常水平,而受体的蛋白表达则稍晚,于致痫后12 h时达到高峰,24 h时开始下降。（3）致痫大鼠mGLuR1α受体表达的最早和高峰时间与TUNEL反应时间基本吻合,结论mGLuR1α表达与致痫大鼠的神经细胞凋亡机制有关,癫痫发作可导致mGLuR1α一过性的高表达,从而造成神经元损伤,其机制可能与致痫后神经细胞的凋亡有关。第三部分mGLuR1拮抗剂（s）-4C3HPG对戊四氮诱导的癫痫发作的影响目的探讨（s）-4C3HPG对癫痫发作的影响及对神经元的保护作用。方法实验SD大鼠14只,分为生理盐水+戊四氮（PTZ）组, （s）-4C3HPG+戊四氮（PTZ）组,每组7只。（s）4C3HPG（500nm0l）经侧脑室注射对大鼠进行预处理,观察它对戊四氮诱导大鼠癫痫发作的行为学的影响,在注射PTZ 12 h时取脑组织标本,制作海马切片,进行组织病理学、神经元凋亡和mGluR1α表达的检测。结果（1）经过（s）-4C3HPG预处理的大鼠致痫的潜伏期延长,（s）-4C3HPG能减轻癫痫发作的严重程度。（2）组织病理学的改变示两组都以水样变性为主,以皮层和海马部位明显,海马部位以CA3区较重,但生理盐水组神经元有明显的坏死,脱落,而（s）-4C3HPG组有少数的神经元变性,坏死.两组比较有显著性的差异（P<0.01）。对TUNEL阳性神经元进行计数,（s）-4C3HPG+PTZ组的阳性神经元明显少于生理盐水+PTZ组。（3）经（s）-4C3HPG作用的大鼠,皮层和海马区的mGluRlα免疫阳性神经元明显较生理盐水+PTZ组减少,mGluRlαmRNA的表达也明显下调.结论癫痫发作后mGluR1α活性的改变与神经元形态的损伤和神经元的凋亡具有相关性,（s）-4C3HPG可减轻PTZ诱发癫痫发作后产生的兴奋毒性作用,对癫痫发作的大鼠具有脑保护作用。第四部分银杏叶提取物和亚低温对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究一银杏叶提取物对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究目的探讨银杏叶提取物（GBE）对癫痫发作的影响及对癫痫发作后脑损伤的保护作用。方法实验SD大鼠42只,随机分为两组,每组21只,分别用于银杏内酯B（GB）对钙超载的影响检测和活体下观察GBE对致痫大鼠的影响。（1）大鼠注射PTZ后出现Ⅳ级发作时乙醚麻醉,断头取脑,制作海马脑片,用人工脑脊液（ACSF）（37℃）孵育脑片,用荧光倒置显微镜检测不同浓度的GB对海马CA3区钙超载的影响,并与对照组相比较。（2）应用GBE（50mg/k）、GBE（100mg/kg）和生理盐水预处理大鼠1h后注射PTZ,活体下观察大鼠行为学的变化,在注射PTZ后12 h将大鼠麻醉,做成海马脑片,进行组织病理学和细胞凋亡的检测。结果（1）GB（150μmol）能明显减轻癫痫大鼠海马CA3区的钙超载,50μmol GB作用不明显。（2）在体实验显示在给予大鼠50mg/kg的GBE时能稍减轻癫痫发作的严重程度和延长癫痫发作的潜伏期,100mg/kg的剂量下作用较显著,海马CA3区的神经元丢失和神经细胞的凋亡数在两种剂量下明显减少,与对照组比较,有显著性差异。而不同剂量的GBE作用也不一样,剂量越大,作用越明显。结论GBE可以减轻癫痫状态下的钙超载,减轻癫痫发作的严重程度,减少神经元的丢失和神经元凋亡,对致痫大鼠具有脑保护作用。二亚低温对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究目的探讨亚低温对致痫大鼠海马神经元的保护作用。方法雄性SD大鼠28只,随机分为4组,头皮温度分别为41℃、37℃、32℃、26℃,每组7只。用冰袋降温、白炽灯泡升温的方法来控制温度。将控制好温度的大鼠用戊四氮（PTZ）诱导癫痫发作,持续观察大鼠发作形式的变化30 min。在大鼠出现癫痫发作后30 min行乙醚麻醉,断头取脑,HE染色,观察海马神经元组织病理学的改变,并选择组织学损害最明显的区域在高倍镜（40×10）下计数神经元的丢失。结果高温状态下癫痫的发作程度最重,神经元的丢失最严重,低温下癫痫的发作程度较轻,神经元的丢失也较少,亚低温下癫痫的发作程度最轻,持续时间也最短,神经元的丢失最少。结论亚低温对癫痫有脑保护作用。第五部分戊四氮致痫猫癫痫发作相关脑区Mn2+增强功能MRI（ME-fMRI）研究目的探讨Mn2’增强功能MRI成像（ME-fMRI）在确定癫痫发作相关脑区的作用。方法成年雄性猫42只,分为两组:（1）戊四氮致痫组（癫痫组）30只,又分为行为学观察组,癫痫发作时组和癫痫发作后24 h组,每组10只。（2）生理盐水对照组12只,其中2只用于同行为学观察组对照,10只用于同ME-fMRI检查的对照。肌注戊四氮（PTZ）（55mg/kg）制作猫癫痫模型,观察猫的行为学和脑电图变化,在急性发作时和癫痫发作后24 h进行ME-fMRI检查;对信号明显增强的脑区做病理学检查并与对照组比较。结果PTZ（55mg/kg）肌注能成功诱导猫癫痫发作。PTZ致痫猫脑电图呈阵发性高波幅棘-慢波。癫痫发作组猫ME-fMRI显示大脑皮质弥漫性明显增强,其中额顶枕叶脑皮质增强率达34.6%,颞叶皮质增强率达约22.9%,与对照组比较有显著性差异（P<0.01）。癫痫发作后24 h组ME-fMRI仍显示额顶叶明显强化,海马的增强率明显增加。强化区的神经元有明显的变性、坏死。结论额顶叶为PTZ致痫猫癫痫发作形成的相关脑区。ME-fMRI能显示癫痫发作的相关脑区和揭示癫痫和钙超载的相关性。

论文目录

• 一、前言
• 二、摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 三、正文
• 第一部分 戊四氮致痫大鼠海马CA3区钙超载与癫痫发病机制的相关性研究
• 1 材料和方法
• 2 统计方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 戊四氮诱导大鼠癫痫发作的mGLuR1α的表达与神经元凋亡
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 mGLuR1拮抗剂（s）-4C3HPG对戊四氮诱导的癫痫发作的影响研究
• 1 材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第四部分 银杏叶提取物和亚低温对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究
• 1 材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 2+增强功能MRI研究'>第五部分 戊四氮致痫猫癫痫发作相关脑区Mn²⁺增强功能MRI研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 四、结论
• 五、附图
• 六、综述一 钙内流与癫痫
• 七、综述二 癫痫灶精确定位的新进展
• 八、攻读博士学位期间发表的主要论文
• 九、英文缩略词表
• 十、致谢