猪链球菌2型LuxS/AI-2型密度感应系统研究

猪链球菌2型LuxS/AI-2型密度感应系统研究

论文摘要

猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是引起猪包括脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等疾病的重要病原。根据其荚膜抗原的不同,猪链球菌分为35个血清型(1-34型,1/2型),其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)是一种重要的人畜共患病病原,可以通过直接接触传染人,是引起人和猪发病最常见的血清型。细菌通常都被认为是自由生活的单细胞生物,绝大部分细菌被认为是被动、独立地响应外界环境的变化,比如趋化性、趋磁性、趋光性等等;而细菌之间、细菌与其他动植物之间、细菌与环境之间被认为没有直接的联系。然而,最近的研究表明,密度感应(quorum sensing, QS)作为细菌中一种普遍存在的调控系统,在细菌间的信息交流中起着重要的作用。密度感应是细菌通过分泌信号分子(Autoinducer, AI)来监测细菌群体密度并协调细菌生物功能的信息交流机制,研究细菌与细菌之间的信息交流已成为微生物学研究的新热点。存在于革兰氏阴性和阳性菌中的luxS/AI-2型密度感应系统,可产生用于细菌种间交流的通用信号分子AI-2。细菌许多生理功能都受此系统的调节,包括质粒的转移、生物被膜(biofilm)的形成、毒力因子的调控和细菌发光等。细菌耐药性的出现迫切需要采用新的方式来进行SS2的防控,干扰或者阻断SS2的细菌密度感应系统,尤其是抑制luxS/AI-2型密度感应系统,可以成为防控SS2的新途径。本研究首次报道在SS2中存在luxS/AI-2型密度感应系统,通过以下6个方面对该系统进行了相关研究:1猪链球茵2型AI-2信号分子检测细菌的luxS基因参与信号分子AI-2合成,luxS/AI-2型密度感应系统参与调控细菌众多的生理功能。猪链球菌2型,是一种重要的人畜共患病病原,为探讨是否SS2也存在luxS/AI-2型密度感应系统,通过哈维弧菌(Vibrio harveyi) BB170对SS2的检测结果表明,SS2可以产生AI-2信号分子;对SS2基因组分析表明,SS2中存在的luxS基因,序列比对结果表明SS2的luxS基因与哈维弧菌的luxS基因有36%同源性和56%的相似性,与其他链球菌的luxS基因同源性都在80%以上,表明在不同的细茵中luxS基因具有高度的保守性;大肠杆菌DH5a互补实验证实在SS2中luxS参与SS2的AI-2信号分子合成。进一步的研究发现,AI-2的产生是生长依赖性的,在对数后期SS2产生的AI-2浓度最大。通过对luxS/AI-2介导的密度感应系统的研究,为进一步研究该系统在SS2中的作用奠定了基础。2重组蛋白LuxS与Pfs的表达与纯化在细菌体内信号分子AI-2的合成涉及Pfs和LuxS两个酶的催化作用。通过对SS2的luxS和pfs基因的测序、克隆和表达,获得了重组的LuxS和Pfs蛋白,用重组蛋白免疫新西兰白兔制备的免疫血清经Western blotting检测具有良好的免疫原性。对44株SS2分离株的luxS和pfs基因的检测结果表明,luxS和pfs在SS2中普遍存在,是SS2中的保守基因。通过对SS2重组蛋白LuxS与Pfs的表达和纯化,为AI-2信号分子的体外合成奠定了基础。3信号分子的体外合成及其影响因素AI-2参与调控细菌一系列重要的生物学功能,但由于缺少商业化的AI-2供应,限制了对AI-2在SS2中调控作用的研究。本实验利用表达纯化的SS2的LuxS和Pfs在体外催化SAH,其产物可以诱导报告菌株哈维弧菌BB170发光,表明SS2的LuxS和Pfs可以在体外催化SAH生成有活性的AI-2分子。进一步的研究表明,在SS2中AI-2的产生来源于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)代谢:SAM在甲基转移酶的作用下生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH), SAH对细菌有毒害作用,细菌通过Pfs迅速降解SAH,产生S-核糖同型半胱氨酸(SRH),LuxS催化SRH形成有活性的AI-2分子。对影响AI-2体外合成因素的研究表明,AI-2的体外合成的最适温度是37℃,最适pH值是8.0;Cr3+,Al3+和Ba2+促进AI-2的体外合成;Fe2+和Ni2+抑制AI-2的体外合成;Hg2+,Cu2+和Mn2+强烈抑制AI-2的体外合成;而金属离子Li+,Mg2+和Zn2+对AI-2的体外合成基本没有影响。通过对AI-2体外合成及其影响因素的研究,为进一步研究AI-2对SS2的调控功能奠定了基础。4 AI-2的产生水平与pfs及luxS转录水平分析AI-2在茵体内的产生受多种因素的影响,例如营养条件、温度、离子强度、pH以及氧气浓度。为了研究影响SS2产生AI-2的因素,本实验利用荧光定量PCR技术研究了SS2不同时期AI-2的产生与luxS和pfs转录水平之间的关系,同时分析了葡萄糖、蔗糖以及NaCl对AI-2产生的影响。结果表明,在SS2中,AI-2的最大活性发生在对数生长后期,这和pfs的最大转录水平相一致,而luxS的最大转录水平却发生在稳定期。此外,NaCl和葡萄糖能促进AI-2分子的合成,而蔗糖对AI-2的生成没有显著影响。Real-time PCR分析表明,NaCl、蔗糖和葡萄糖都能显著增加luxS的转录水平,然而只有NaCl和葡萄糖能增加pfs的转录水平,蔗糖对pfs的转录水平没有显著的影响。这些结果表明,AI-2的产生水平与pfs转录水平一致,而与luxS转录水平并不一致。5噬菌体肽库筛选LuxS可能的抑制性多肽噬菌体展示技术是用来快速筛选抗体、酶、受体和细胞因子等靶蛋白配体的有效工具。本研究运用噬茵体展示技术,通过3轮的生物淘选和ELISA检测,筛选到20个阳性克隆,测序结果表明,在20个阳性克隆中有14个都含有相同的基序HSIR,表明LuxS含有与HSIR结合的结合位点,且该位点与HSIR的亲和力高。多肽抑制实验表明,多肽TNRHNPHHLHHV能部分抑制LuxS催化SRH生成AI-2,加入多肽TNRHNPHHLHHV后,LuxS催化SRH形成AI-2的浓度从200μmol降低到150μmol,抑制效率为25%。其余合成多肽对LuxS的活性基本没有影响。LuxS可能的抑制性多肽与高亲和力配体的发现,为开发潜在的抑制剂,抑制SS2的luxS/AI-2型密度感应系统以及SS2的防控提供了新的可能途径。6 AI-2对SS2粘附性的影响以及相关基因的调控AI-2作为细茵间的通用信号分子,参与细菌众多生理功能的调控,为了研究信号分子AI-2在SS2对HEp-2细胞粘附中的作用,在SS2对该细胞的粘附实验中加入不同浓度的AI-2。结果表明AI-2在浓度为4 umol时,SS2对该细胞的粘附性达到最大为144%,随着AI-2浓度的增加,SS2对该细胞的粘附性逐渐降低,当AI-2浓度为16umol时,SS2对该细胞的粘附性降低到58%。此外,荧光定量PCR结果表明AI-2促进pfs的转录,抑制luxS的转录;促进毒力因子cps、mrp、sly、gdh和fbps转录,抑制ef转录;促进编码具有免疫原性蛋白的基因MEP, hsp和AbpB的转录,抑制DAP的转录。进一步表明AI-2参与调控SS2众多的生理功能。通过对SS2 luxS/AI-2型密度感应系统研究,不仅为防控SS2感染,从细菌群体角度提供了新的思路,而且为进一步研究QS对SS2的调控功能及其机理奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 第一篇 文献综述
  • 第一章 猪链球菌2型的研究进展
  • 1 病原学
  • 2 流行病学
  • 3 猪链球菌2型的毒力因子
  • 3.1 荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)
  • 3.2 猪溶血素(suislysin,SLY)
  • 3.3 溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)
  • 3.4 胞外因子(Extracellular protein factor,EF)
  • 3.5 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)
  • 3.6 黏附素(adhesin)
  • 3.7 纤连蛋白(Fibronectin,Fn)和血纤蛋白原(Fibrinogen,Fgn)的结合蛋白(Fibronectin and fibrinogen-bining protein,FBPS)
  • 3.8 毒力相关序列orf2
  • 3.9 其他的毒力因子
  • 4 SS2致病机制的研究
  • 4.1 粘附机制
  • 4.2 侵袭机制
  • 5 猪链球菌2型感染动物模型研究进展
  • 5.1 斑马鱼
  • 5.2 巴马小型猪
  • 6 猪链球菌2型蛋白质组学研究进展
  • 7 猪链球菌2型的分子生物学检测方法
  • 7.1 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)
  • 7.2 随机扩增核酸片段多态性分析(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)
  • 7.3 利用16S rRNA对SS的鉴定和分群
  • 7.4 限制性内切酶图谱分析法(restriction map analysis,REA)
  • 7.5 脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)
  • 参考文献
  • 第二章 密度感应系统综述
  • 1 细菌群体感应的类型
  • 1.1 革兰氏阴性细菌的LuxR-LuxI信号系统
  • 1.2 革兰氏阳性细菌的密度感应系统
  • 1.3 LuxS/AI-2型密度感应系统
  • 2 LuxS/AI-2型密度感应系统的调控功能
  • 3 密度感应系统的研究意义与应用
  • 3.1 降低R蛋白的活性
  • 3.2 降解信号分子
  • 3.3 阻断信号分子的合成
  • 参考文献
  • 第二篇 试验研究
  • 第三章 链球菌2型AI-2信号分子检测
  • 1 材料与方法
  • 1.1 菌株与载体
  • 1.2 主要试剂与培养基
  • 1.3 主要仪器
  • 1.4 SS2信号分子AI-2检测
  • 1.5 SS2在不同生长时期AI-2信号分子检测
  • 1.6 SS2的AI-2信号分子合成基因luxS的克隆
  • 1.7 互补实验
  • 2 结果
  • 2.1 SS2产生AI-2样信号分子
  • 2.2 SS2在不同生长阶段AI-2信号分子的检测
  • 2.3 AI-2信号分子合成基因luxS的克隆
  • 2.4 互补实验
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第四章 重组蛋白LuxS与Pfs的表达与纯化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 菌种、载体与培养基
  • 1.2 luxS和pfs的表达
  • 1.3 重组LuxS和Pfs的纯化
  • 1.4 多克隆抗血清的制备
  • 1.5 ELISA检测多抗效价
  • 1.6 表达产物的Western Blot检测
  • 2 结果
  • 2.1 luxS与pfs的PCR扩增
  • 2.2 重组质粒的鉴定
  • 2.3 重组LuxS与Pfs的表达与纯化
  • 2.4 重组LuxS与Pfs多克隆抗体的制备与western blotting检测
  • 2.5 luxS与pfs在SS2中的分布检测
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第五章 信号分子的体外合成及其影响因素
  • 1 材料与方法
  • 1.1 信号分子AI-2的体外合成
  • 1.2 信号分子AI-2的活性检测
  • 1.3 信号分子AI-2的浓度测定
  • 1.4 温度对信号分子AI-2产生的影响
  • 1.5 pH值对信号分子AI-2重生的影响
  • 1.6 金属离子对AI-2信号分子产生的影响
  • 2 结果
  • 2.1 信号分子的合成与检测
  • 2.2 信号分子体外合成的浓度检测
  • 2.3 温度对信号分子AI-2产生的影响
  • 2.4 pH值对信号分子AI-2重生的影响
  • 2.5 金属离子对AI-2信号分子产生的影响
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第六章 AI-2的产生及其与pfs及luxS转录水平分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 不同培养条件下AI-2的检测
  • 1.2 不同培养时期AI-2的检测
  • 1.3 SS2总RNA的提取
  • 1.4 引物设计
  • 1.5 cDNA的合成
  • 1.6 Real-time PCR定量方法
  • 2 结果
  • 2.1 不同培养条件下AI-2的检测
  • 2.2 SS2在不同生长阶段AI-2信号分子的检测
  • 2.3 SS2在不同生长时期luxS和pfs mRNA转录水平分析
  • 2.4 SS2在不同培养条件下luxS和pfs mRNA转录水平分析
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第七章 噬菌体肽库筛选LuxS可能的抑制性多肽
  • 1 材料与方法
  • 1.1 主要试剂
  • 1.2 噬菌体生物淘选过程
  • 1.3 SRH的制备
  • 1.4 多肽的合成
  • 1.5 多肽抑制实验
  • 2 结果
  • 2.1 亲和性噬菌体筛选
  • 2.2 ELISA筛选阳性噬菌体
  • 2.3 噬菌体测序和序列分析
  • 2.4 多肽抑制性实验
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第八章 AI-2对SS2粘附性及其转录水平的影响
  • 1 材料与方法
  • 1.1 细菌培养
  • 1.2 细胞的培养
  • 1.3 AI-2信号分子合成与浓度测定
  • 1.4 SS2对Hep-2细胞的粘附实验
  • 1.5 SS2对Hep-2细胞的侵袭实验
  • 1.6 荧光定量引物的设计
  • 1.7 细菌总RNA的提取
  • 1.8 cDNA合成
  • 1.9 荧光定量检测AI-2对SS2主要毒力因子的影响
  • 2 结果
  • 2.1 AI-2对SS2粘附与侵袭Hep-2细胞的影响
  • 2.2 AI-2对pfs和luxS的转录影响
  • 2.3 AI-2对SS2主要毒力因子的转录影响
  • 2.4 AI-2对SS2几种免疫原性蛋白基因的转录影响
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 致谢
  • 博士期间发表及待发表论文
  • 相关论文文献

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