胡泽锴毛腾霄
(成都市食品药品检验研究院610000)
【摘要】目的：建立氧化锌洗剂的微生物限度检查方法。方法：采用常规法、薄膜过滤法对氧化锌洗剂的微生物限度检查进行试验。结果：供试品5种试验菌回收率均>70%，控制菌能正常检出。结论：应采用薄膜过滤法对细菌数和金黄色葡萄球菌控制菌进行检查；采用常规法对霉菌和酵母菌数以及铜绿假单胞菌控制菌进行检查。
【关键词】氧化锌洗剂；微生物限度检查法；薄膜过滤法
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）25-0356-03
ErificationoftheMicrobialLimitTestfortheZincOxideLotion
HuZekai，MaoTengxiao
(InstituteforFoodandDrugcontrolofChengdu,Chengdu610000)
【Abstract】Objective:ToestablishamethodofmicrobiallimittestsforAcneZincOxidelotion.MethodsRoutinemethodandmembranefiltrationmethodwereusedforthetestoftheZincOxidelotion.ResultsTherecoveriesweremorethan70%andthequalityofcontrolgermcheckwascredible.ConclusionBacteriaandClostridiumsporogenesandPseudomonasaeruginosaweretestedbymembranefiltrationmethod.Moldsandyeastsweretestedbytheroutinemethod.
【Keywords】ZincOxidelotion;Microbiallimittests;Membranefiltration
氧化锌洗剂为外用制剂，主要成分为氧化锌、薄荷脑，具有抗菌消炎作用。按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法标准规定，细菌数应不得过100cfu/ml，霉菌和酵母菌数应不得过100cfu/ml，金黄色葡萄球菌每1ml不得检出，铜绿假单胞菌每1ml不得检出。本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法，确保方法的有效性，我们按药典要求进行了方法验证实验。
方法验证
1.仪器、样品、菌种及培养基
1.1实验样品
氧化锌洗剂（由空军总医院提供）
规格：100ml/瓶批号：140325131213140401（以下简称1、2、3批）
1.2菌种大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。
1.3仪器
洁净工作台（苏净集团安泰公司）编号：02180009
隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）编号：02210051
LRH250生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）编号：02210053
STV3无菌检查薄膜滤器（浙江宁海白石药检仪器厂）编号：02260080
1.4培养基
营养肉汤培养基批号：121023营养琼脂培养基批号：130522
玫瑰红钠琼脂培养基批号：1305292甘露醇氯化钠琼脂培养基批号：110713
胆盐乳糖培养基批号：130410溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基批号：1302052
1.5稀释液
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：130422），以上均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。
2.方法
2.1细菌数、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.1.1常规法测定细菌、霉菌及酵母菌数的方法验证
2.1.1.1菌液制备[1]
按《中国药典》2010年版二部要求，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌50-100cfu/ml的菌悬液；制备白色念珠菌50-100cfu/ml的菌悬液，黑曲霉50-100cfu/ml的孢子悬液作活菌计数用；
2.1.1.2供试液制备[2]
取本品10ml，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇混匀，500转/分离心3min，取上清液，得1:10供试液。
2.1.1.3回收率测定
2.1.1.3.1供试品组
取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；
取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。
2.1.1.3.2菌液组
分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置35℃培养3天，测定所加的试验菌数。
取白色念珠菌试验菌悬液1mL，注入平皿，平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养4天，测定所加的试验菌数。
取黑曲霉菌悬液1mL，注入平皿，平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养4天，测定所加的试验菌数。
2.1.1.3.3试验组
取1:10供试液1mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别注入平皿
中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数；
取1:10供试液1mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1ml倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25℃培养5天，计数。
2.1.1.4结果
试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品本底菌数)/菌液组菌数×100%。结果如表1所示。
表1常规法菌落计数验证结果（单位：cfu）
如表1所示，本品采用常规法检查，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均为0，说明本品对细菌具有较强的抑菌作用；供试品对白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，说明可采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌的检查。
2.1.2稀释法测定细菌数的方法验证
2.1.2.1菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的制备见2.1.1.1
2.1.2.2供试液制备见2.1.1.2
2.1.2.3回收率测定
2.1.2.3.1供试品组
取1:10供试液1ml，等量注入5个平皿中，每皿0.2mL，平行重复2次，测定供试品本底细菌数；
2.1.2.3.2菌液组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌菌液组，见2.1.1.3.2
2.1.2.3.3试验组
取1:10供试液0.2mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别注入平皿
中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数。
2.1.2.4结果
试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品本底菌数)/菌液组菌数×100%。结果如表2所示。
表2稀释法菌落计数验证结果（单位：cfu）
注：表中菌落数为稀释法中各个平皿计数之和
如表2所示，采用稀释法（0.2mL/皿），供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均低于70%，说明应采用其它方法检查。
2.1.3薄膜法测定细菌数的方法验证[3]
取1:10供试液1ml过滤，用300ml无菌pH7.0氯化钠-蛋白栋缓冲液冲洗，在最后一次冲洗时分别加入1ml大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液。取出滤膜，菌面朝上，帖于营养琼脂平板上。置35℃培养3天，计数。菌液组、供试品对照组，稀释剂对照组同法操作。结果见表3，表中可看出采用薄膜过滤法检查，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种试验菌的回收率均高于70%，说明可采用薄膜法进行细菌计数检查。
表3薄膜法菌落计数验证结果（单位：cfu）
2.2控制菌检查方法的验证
2.2.1方法。取1:10供试液10ml，用集菌仪过滤，用400ml稀释剂冲洗4次，在最后一次冲洗液中分别加入1ml相应的试验菌株，取出滤膜，放入相应菌培养基中（检查金黄色葡萄球菌放入100ml营养肉汤培养基中，检查铜绿假单胞菌放入胆盐乳糖培养基中），置35℃培养20h。分别取培养物，划线接种于平板上（检查金黄色葡萄球菌采用甘露醇氯化钠琼脂培养基，检查铜绿假单胞菌采用溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基）。培养20小时，观察。
2.2.2结果采用薄膜法可以检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
3.讨论
氧化锌洗剂为局部给药制剂，本品可采用常规法进行霉菌和酵母菌计数，采用离心沉淀配合薄膜过滤法进行细菌计数和控制菌检查。薄膜过滤时，采用少量多次冲洗的方法可以有效地消除抑菌性。
【参考文献】
[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[Z]．北京：化学工业出版社，2005：附录XIJ．
[2]马绪荣，苏德模．药品微生物学检验手册[M]．北京：科学出版社，2000：65．
[3]桑国卫．中国药品检验标准操作规范[M]．北京：中国医药科技出版社，2005：325．