猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究

论文摘要

皮肤的表皮终生处于增殖、分化和脱落的不断更新之中，这正是由于其中表皮于细胞（Epidermal Stem Gells，ESCs）不断增殖分化所致。表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能力，且能分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能。开展分离纯化表皮干细胞建系研究，为表皮干细胞应用于医学临床的组织工程和人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。本研究以五指山实验用小型猪（Wu Zhi Shan Pigs，WZSP）近交系的耳组织为材料，分别从不同日龄猪、不同胶原、条件培养基和表皮生长因子等方面对ESCs分离培养的影响进行了研究，旨在探索ESCs的最佳分离培养条件，并在该条件下建立三个表皮干细胞系，对所培养的ESCs进行了染色及免疫组化鉴定。得出研究结果如下：1．不同因素对猪表皮干细胞分离培养的影响研究采集4日龄、1月龄、3月龄、12月龄猪耳组织分离表皮干细胞，分别计算各组细胞的贴率。结果表明，随着实验猪日龄的增长，表皮干细胞的贴壁率逐渐降低，其中4日龄组贴壁率为12.68±1.11％，1月龄组为9.76±0.68％，根据ESCs所占表皮细胞约10％的比例，这两组最适宜作为分离纯化表皮干细胞的材料。将分离得到的表皮细胞分为两组，一组接种于Ⅰ型胶原包被的六孔板中，另一组接种与Ⅳ型胶原包被的六孔板中，15min后洗去未贴壁细胞，计算两组细胞的贴壁率。结果表明，Ⅰ型胶原组贴壁率为28.76±1.71％，Ⅳ型胶原组贴壁率为11.16±1.43％，由此可见，Ⅰ型胶原不适宜作为筛选表皮干细胞的基质。将分离纯化出的表皮干细胞分为两组，一组采用条件培养基培养，另一组采用DMEM／F12（1∶1）+15％血清培养。结果表明，条件培养基培养组细胞生长状况良好，呈克隆状生长，且传几代之后也不易发生分化，而有血清培养基培养组细胞生长速度非常缓慢，且从第二天开始就出现了分化现象，以后分化细胞逐渐增多，不能够形成克隆状。因此，在没有饲养层的条件下，表皮干细胞的培养必须添加条件培养基。分离纯化出的表皮干细胞分为四组，分别用含0ng／ml，10ng／ml，20ng／ml和30ng／ml表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）的培养液培养，绘制每组细胞的生长曲线。结果表明，10ng／ml、20ng／ml和30ng／ml浓度的EGF下ESCs生长曲线没有明显的差别（P＞0.05），而不含EGF的培养液细胞增殖速度显著低于其他各组（P＜0.05）。2．猪表皮干细胞的建系研究采集WZSP实验用近交系耳组织，通过中性蛋白酶消化获得表皮，再通过0.25％胰酶+0.02％EDTA消化制成单个表皮细胞悬液，接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶内，采用条件培养基（DMEM／F12（1∶1）+10％条件培养液+5μg／mL insulin+20ng／mL EGF+20ng／mL IGF-Ⅰ+0.5μg／mL氢化可的松）培养，0.25％胰酶消化传代。表皮干细胞能够快速黏附在Ⅳ型胶原上，呈克隆状生长，一般传代间隔为7天左右。已建立三个表皮干细胞系，均已传至20代以上。3．猪表皮干细胞的鉴定及分化研究取生长良好的第10代表皮干细胞进行AKP染色鉴定，结果呈阳性。K19和β1整合素免疫组化染色亦均呈阳性。证明所分离得到的细胞为表皮干细胞。将消化传代ESCs接种在铺明胶的培养瓶中培养3周左右，可逐渐分化成表皮膜片。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 综述一 成体干细胞研究进展
• 1.1 干细胞概述
• 1.2 成体干细胞的分类
• 1.3 成体干细胞的生物学特性
• 1.4 成体干细胞的可塑性
• 1.5 成体干细胞的应用
• 综述二 表皮干细胞研究进展
• 2.1 引言
• 2.2 表皮干细胞的定位和在体分布模式
• 2.3 表皮干细胞的生物学特性
• 2.4 表皮干细胞的鉴定及其表面标志
• 2.5 表皮干细胞与微环境
• 第二章 实验研究
• 实验一 不同因素对猪表皮干细胞分离培养的影响研究
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 实验二 猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 实验三 猪表皮干细胞的鉴定及分化研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第三章 全文结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历