纳米含砷化合物诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

论文摘要

目的:研究人工合成纳米含砷化合物As2S3（直径<100nm）（以下简称As2S3）诱导肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制、凋亡形态学改变及促凋亡作用,为寻求新的肝癌治疗策略提供理论依据。方法:1实验分三组: As2S3组、As2O3组（用三蒸水稀释As2O3粉末至所需要的浓度）、空白对照组（加培基）,应用血清药理学方法通过四甲基偶氮唑蓝比色法（简称MTT法）观察As2S3对肝癌细胞SMMC-7721体外增殖的抑制作用。As2S3组选取终浓度为1、2、4、8μmol/L四个浓度,分24、48、72小时三个时间点干预细胞,筛选As2S3对人肝癌细胞SMMC-7721增殖抑制的最佳浓度和时间,As2O3组处理方法同As2S3组,空白对照组加培基。常规培养细胞,进入对数生长期后,贴壁细胞弃去上清,PBS缓冲液冲洗2遍,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,用RPMI1640培基调整细胞为1×105个细胞/ml,接种于96孔培养板,每孔1×104个细胞/100μl,培养24小时待细胞贴壁后按实验分组加入不同浓度药物,空白对照组加入100μl培基,每组浓度5个重复孔,放入37℃、5% CO2培养箱培养24小时、48小时、72小时后,每孔加入MTT 20μl,再培养4小时,弃上清液,每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl振荡溶解10分钟,待甲瓒完全溶解后进行比色,酶标仪检测吸光度（OD）值,波长λ=570nm,计算药物对肿瘤细胞的抑制率。计算公式:抑制率（%）=（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%2采用透射电镜观察As2S3作用于人肝癌细胞SMMC -7721的形态变化和凋亡情况。根据MTT实验结果,取肝癌细胞SMMC-7721（5×106/ml）悬液移至无菌细胞培养瓶,加入终浓度为8μmol/L的As2S3和8μmol/L的As2O3,空白对照组加入培基,置37℃,5% CO2的培养箱中,培养72小时后收集细胞,经2.5%戊二醛溶液前固定,1%锇酸后固定,逐级酒精脱水,树脂包埋,超薄切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色于透射电镜（日本日立H-7500型）下观察凋亡细胞的超微结构变化。3用流式细胞术（FCM）检测As2S3作用于人肝癌细胞SMMC-7721的细胞周期和细胞凋亡率。根据MTT实验结果,用终浓度为8μmol/L的As2S3和8μmol/L的As2O3,空白对照组加培基,作用于肝癌细胞SMMC-7721,处理72小时后,离心收集细胞,应用PBS液洗涤2次,加入70%乙醇固定,离心去除上清液,加入200μl RNA酶在37℃处理1小时,然后加800μl PI染色液放置4℃冰箱内30分钟以上,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果:1 MTT法结果显示2-8μmol/L的As2S3对肝癌细胞SMMC-7721体外生长有明显的增殖抑制作用,1μmol/L抑制作用不明显,抑制率最高的浓度与时间是8μmol/L和72小时,As2O3对肝癌细胞SMMC-7721体外生长也有明显的增殖抑制作用,其抑制率最高的是8μmol/L和72小时,且两者均有浓度和时间的依赖性,抑制率和浓度与时间成正比,As2S3组的抑制率高于As2O3组和空白对照组（P<0.05）。2透射电镜结果显示经8μmol/L的As2S3作用72小时的肝癌细胞SMMC-7721,可看到线粒体的大部分嵴融合或消失,模糊不清,胞质内可见到满视野大小不等的空泡典型的凋亡形态学改变,而经8μmol/L的As2O3作用72小时的肝癌细胞SMMC-7721可见到空泡数量不及As2S3,空白对照组没有什么变化。3流式细胞分析结果显示经8μmol/L的As2S3作用72小时的肝癌细胞SMMC-7721有明显的促凋亡作用,凋亡率为18.4%,经8μmol/L As2O3作用72小时的肝癌细胞SMMC- 7721的凋亡率是14.4%,空白对照组的凋亡率为2.2%,As2S3组的凋亡率高于As2O3组和空白对照组（P<0.05）。三者细胞周期比较,As2S3作用72小时肝癌细胞SMMC-7721的G2/M期细胞增多,G0/G1期细胞减少,S期细胞减少,表明细胞周期阻滞在G2/M期。结论:通过实验结果可以证实,As2S3对肝癌细胞株SMMC- 7721有较强的体外增殖抑制作用,抑制率与浓度和时间成正相关。可观察到肝癌细胞株SMMC-7721的凋亡形态学改变,并且具有诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡,引起细胞周期阻滞的作用,其作用优于As2O3。

论文目录

• 中文摘要
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• 研究论文 纳米含砷化合物诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 含砷化合物抑制肿瘤作用机制的研究进展
• 致谢
• 个人简历