核内小分子对PCR增效作用的研究

论文摘要

随着PCR技术的逐步完善与普及,关于PCR增效剂的研究已经成了国内外各大实验室研究的热点。本课题通过生物信息学手段从酿酒酵母细胞核代谢通路中查找了到近百种核内小分子,它们大多是一些氨基酸、核苷酸或其结构类似物。通过对这些核内小分子进行大规模筛选实验,最终验证得到可以大幅度增进基因扩增效率的七种核内小分子。此外本课题中还对这七种小分子的增效机制及其相关PCR实验体系做了初步测试。这几种核内小分子很有可能成为新型的PCR增效剂,并把PCR技术提升一个台阶。本课题主要从四个方面对核内小分子进行研究。分别为核内小分子的查找、增效小分子的筛选、增效小分子作用机制的研究以及核内小分子PCR扩增体系灵敏度和稳定性测试。核内小分子的查找与筛选过程主要采用生物信息学方法和批量规模化实验的方式进行。在酿酒酵母细胞核代谢通路中共查找得到了常见的核内小分子96种,然后分别针对普通PCR扩增和高GC含量基因片段的扩增两大PCR实验模型进行实验,前后共筛选出有明显增效作用的核内小分子七种,分别为23号肌苷、29号异亮氨酸、30号L-亮氨酸、31号甲硫氨酸、32号缬氨酸、45号尿嘧啶以及47号尿苷。核内小分子增效机制的研究是采用实时定量PCR和rpsl基因正向筛选系统两个实验模型进行测试的。经初步研究发现部分小分子可以显著提高DNA复制速度并降低目的基因片段的Tm值,而且在对这些小分子进行保真性测试中未发现它们会对DNA复制的忠实度造成明显的影响。最后本课题针对七种小分子扩增体系进行了灵敏度和稳定性测试,测试结果发现大多数核内小分子涉及的PCR体系的灵敏度较普通PCR体系高出10倍左右,且可以保证在反复扩增PCR中延长PCR循环次数到第三次。由此可见核内小分子在PCR扩增过程中所发挥的作用。本课题中验证的七种核内小分子的增效作用均是本实验室首次发现的,具备自主知识产权,且已申请专利保护。我们希望这几种新型PCR增效剂的发现不仅可以造福更多实验室,还可以为新型PCR试剂盒的研发打下基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 课题来源
• 1.2 研究目的及意义
• 1.3 研究背景及其国内外研究现状分析
• 1.3.1 PCR技术的发明、发展及其基本原理
• 1.3.2 不同类型PCR原理与应用概述
• 1.3.3 PCR反应系统的组成及影响PCR反应的因素
• 1.3.4 PCR添加剂研究概述
• 1.4 课题研究的主要内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料与主要实验仪器设备
• 2.1.1 核内小分子的查找与筛选
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 主要实验仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物的设计、合成与配置
• 2.2.2 基因组模板的制备
• 2.2.3 实验试剂的配置
• 2.2.4 PCR产物的检测方法
• 2.3 核内小分子PCR扩增体系实验模型的确立
• 2.3.1 普通PCR扩增实验模型的确立
• 2.3.2 高GC片段扩增PCR实验模型的确立
• 2.3.3 实时定量PCR实验模型的确立
• 2.3.4 保真性测试实验模型的确立
• 2.3.5 灵敏度测试实验模型的确立
• 2.3.6 稳定性测试实验模型的确立
• 2.4 本章小结
• 第3章 核内小分子对不同PCR模型增效作用研究
• 3.1 核内小分子对普通PCR的扩增
• 3.1.1 增效小分子的初步筛选
• 3.1.2 增效小分子的组合效应验证实验
• 3.2 核内小分子对高GC含量基因片段的扩增
• 3.2.1 增效小分子的初步筛选
• 3.2.2 增效小分子的组合效应验证实验
• 3.3 本章小结
• 第4章 核内小分子增效作用机制的初步研究
• 4.1 核内小分子对DNA体外复制速度的影响
• 4.1.1 核内小分子对DNA扩增延伸时间的影响
• 4.1.2 核内小分子对DNA扩增退火时间的影响
• 4.2 核内小分子对DNA扩增融解曲线的影响
• 4.2.1 核内小分子对目标序列Tm值的影响
• 4.2.2 核内小分子与不同添加剂间的扩增效果比较
• 4.3 核内小分子对DNA复制忠实性的影响
• 4.4 本章小结
• 第5章 PCR系统的灵敏度和稳定性测试
• 5.1 核内小分子PCR系统灵敏度测试
• 5.2 核内小分子PCR系统稳定性测试
• 5.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢