人红细胞血型糖蛋白B单克隆抗体的制备

论文摘要

红细胞血型是指红细胞膜上特异性抗原的类型。血型研究在输血安全,法医鉴定,遗传疾病研究中意义重大。20世纪末,已经发现了29个血型系统,600多种血型抗原,使得血型研究成为一门独立的学科发展起来。血型糖蛋白B（GPB）是红细胞膜上重要的抗原之一,分为S和s抗原亚型,属于MNSsU血型系统。Ss抗原的不同在于:在GPB抗原多肽链中,第48位氨基酸为M时,表现为为S型抗原,为T时则表现为s型抗原。它们在人群中约各占48%和52%,正常人红细胞均表达GPB蛋白。抗S和抗s为温性IgG抗体,常在输血免疫后产生,可引起明显的溶血性输血反应,因此血型单抗做为临床上血型定型试剂,是必不可少的。通过RT-PCR方法从K562细胞中克隆GPB基因,并将其克隆入T载体。将序列正确的GPBs经双酶切后克隆进pcDNA3.1-His-Myc A载体,用重组真核表达载体转染CHO细胞,经G418筛选得到了阳性克隆;用RT-PCR及Western blot等方法对稳定转染GPBs的CHO细胞进行检测,获得了稳定表达GPBs的CHO细胞系。同时,将克隆出GPBs的抗原胞外区基因序列克隆进pGEX 4T-2原核表达载体,将测序结果正确的原核重组菌经IPTG诱导表达,获得GST-GPBs胞外区的融合蛋白抗原。用红细胞、GPBs转基因细胞和原核表达的纯化抗原作为免疫源免疫小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,通过红细胞血凝试验、ELISA、Western blot等方法成功筛选出1株抗GPBs胞外区的特异性单克隆的杂交瘤株。采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤上清及部分McAb腹水效价;通过试剂盒亚型鉴定,获得的抗体为IgG型单抗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 1 红细胞血型研究及其发展历史
• 1.1 输血的发展
• 1.2 红细胞血型的发现
• 1.3 红细胞血型研究的发展
• 2 血型抗原及血型系统
• 3 血型糖蛋白B（GPB）
• 4 本研究的目的和意义
• 5 本研究的技术路线
• 第一部分 人红细胞血型糖蛋白 B 基因的克隆与真核表达
• 1 材料
• 1.1 质粒、细菌、细胞
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 GPB 基因的获得
• 2.2 pTZ57R/T Easy-GPB 载体的构建
• 2.3 pcDNA3.1-His-Myc A/GPBs 真核表达载体的构建
• 2.4 重组质粒转染CHO 细胞
• 2.5 稳定转染GPBs 的CHO 细胞检测
• 3 结果
• 3.1 GPB 基因的获得
• 3.2 质粒pTZ57R/T Easy-GPB 的构建
• 3.3 pcDNA3.1-His-Myc A-GPB 真核表达载体的构建
• 3.4 稳定转染GPBs 的CHO 细胞的检测
• 4 讨论
• 第二部分 GPBs 胞外区多肽抗原的原核表达
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 GPBs 胞外区基因的获得
• 2.2 原核表达载体pGEX 4T-2 的构建和克隆
• 2.3 pGEX 4T-2-GPBs 多肽的原核表达
• 2.4 pGEX 4T-2-GPBs 原核表达的GST 融合多肽的纯化
• 3 结果
• 3.1 GPBs 胞外区基因的获得
• 3.2 构建pGEX 4T-2-GPBs 原核表达载体测序鉴定
• 3.3 GST-GPBs 融合蛋白表达检测
• 3.4 GST-GPBs 融合蛋白的纯化结果
• 4 讨论
• 第三部分 GPBs 单克隆抗体的制备
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验动物
• 2 方法
• 2.1 免疫小鼠
• 2.2 饲养细胞的准备
• 2.3 骨髓瘤细胞的准备
• 2.4 脾淋巴细胞的准备
• 2.5 细胞融合及杂交瘤细胞的选择性培养
• 2.6 杂交瘤细胞的检测
• 2.7 单克隆抗体的效价测定
• 2.8 单克隆抗体亚型的测定
• 2.9 单抗的大量制备
• 2.10 单克隆抗体对血型的检测
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤株的建立
• 3.2 单克隆抗体的特异性鉴定
• 3.3 单抗的类型及效价测定结果
• 4 讨论
• 4.1 免疫原
• 4.2 阳性杂交瘤株的筛选
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文