鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其鉴定

论文摘要

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis, IB）是一种由鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）引起的急性、高度接触传染性呼吸道疾病。它主要引起鸡呼吸道或肾脏感染,蛋鸡的产蛋数量和产蛋品质下降等。IBV为冠状病毒（Coronavirus）γ亚群的代表成员,由于其基因组易发生突变和重组,加之不同血清型之间缺乏交叉保护作用,虽然疫苗一直在广泛的使用,但IB仍不断地爆发和流行,给养禽业带来了严重的经济损失。单克隆抗体针对病毒特定的抗原表位结构,具有较强的特异性,对该病的诊断及基因工程疫苗的设计具有重要意义。N蛋白是诱导机体免疫应答和细胞免疫应答的重要免疫原蛋白。本研究以IBV N蛋白作为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的诊断、预防和控制具有一定的意义。实验首先从鸡胚培养的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因组RNA,然后利用软件对其N蛋白抗原表位进行预测分析,设计一对特异性引物对免疫原性好、亲水性强、表位可能性大的保守片段进行了扩增,片段大小为818 bp；将其与表达载体pET-32a（+）连接并转入大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE检测表达的重组N蛋白大小为50kDa;用Ni-NTA Superflow纯化重组N蛋白后,采用抗鸡IBV血清与之进行Western blot反应以检测其反应原性,结果显示重组蛋白反应原性良好。采用纯化的重组N蛋白加以弗氏佐剂对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,发现免疫后的小鼠均能产生高效价的抗体,可用于细胞融合。将SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合,融合后2周左右用间接ELISA方法对其进行抗体效价检测,将筛选到的阳性细胞孔进行3-4次亚克隆化,最终得了2株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2833和4E10。经测定,2株单抗亚类分别为IgGl和IgM,轻链均为K链；通过腹水诱导法大量制备的腹水和细胞培养上清抗体效价分别大于106和1：640；这两株单克隆抗体具有良好的特异性,均能与IBV N蛋白发生特异性的反应；经检测,2株杂交瘤细胞均具有良好的传代稳定性。这两株抗IBV N蛋白单克隆抗体研制的成功,对进一步研究IBV N蛋白及建立鸡传染性支气管炎的诊断方法有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略名词对照表
• 目录
• 第一章 文献综述及选题目的意义
• 1. 鸡传染性支气管炎概述
• 1.1 病原学
• 1.2 基因组结构
• 1.3 结构蛋白及其生物学功能
• 1.4 IBV的流行病学
• 2. 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白N研究进展
• 2.1 N基因遗传学研究
• 2.2 N蛋白结构研究进展
• 2.3 N蛋白生物学功能
• 2.4 N蛋白抗原表位研究
• 3. IBV单克隆抗体的制备及应用研究进展
• 3.1 IBV单克隆抗体研究进展
• 3.2 IBV单克隆抗体的应用
• 4. 选题目的意义
• 第二章 鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白制备与抗原性检测
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 常用试剂配制
• 1.5 IBVN蛋白基因扩增与克隆
• 1.5.1 病毒的制备
• 1.5.2 病毒RNA提取
• 1.5.3 PCR扩增N蛋白基因
• 1.5.4 N蛋白基因的TA克隆
• 1.5.5 连接产物的转化
• 1.5.6 重组质粒的筛选和鉴定
• 1.6 N蛋白表达载体的构建
• 1.6.1 带粘性末端N蛋白基因和载体pET-32a（+）的制备
• 1.6.2 连接及转化
• 1.6.3 重组表达质粒的酶切鉴定
• 1.7 重组N蛋白的表达、纯化及抗原性鉴定
• 1.7.1 N蛋白基因的诱导表达及鉴定
• 1.7.2 表达条件的筛选优化
• 1.7.3 重组蛋白的纯化
• 1.7.4 重组蛋白Western Blot分析
• 2. 结果
• 2.1 N基因的扩增与克隆
• 2.1.1 N基因生物信息学分析
• 2.1.2 N蛋白基因RT-PCR结果
• 2.1.3 重组质粒pMD19-T-N的鉴定
• 2.2 N蛋白表达载体的构建
• 2.3 重组N蛋白的表达、纯化及抗原性检测结果
• 2.3.1 重组N蛋白表达产物SDS-PAGE鉴定结果
• 2.3.2 表达条件的筛选结果
• 2.3.3 重组蛋白的纯化效果鉴定
• 2.3.4 重组蛋白Western Blot分析结果
• 3. 讨论
• 第三章 鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 常用试剂配制
• 1.5 动物免疫
• 1.6 间接ELISA方法的建立
• 1.6.1 最佳抗原抗体工作浓度的确定
• 1.6.2 阴阳性临界值确定
• 1.7 单克隆抗体的制备
• 1.7.1 免疫BALB/c小鼠血清效价测定
• 1.7.2 细胞制备
• 1.7.3 细胞融合
• 1.7.4 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 1.7.5 杂交瘤细胞的亚克隆
• 1.7.6 阳性杂交瘤细胞冻存与复苏
• 1.7.7 单克隆抗体腹水的制备
• 1.7.8 单克隆抗体的纯化
• 1.8 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定
• 1.8.1 杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体的ELISA效价测定
• 1.8.2 抗体亚型鉴定
• 1.8.3 Western blot分析
• 1.8.4 交叉反应性鉴定
• 1.8.5 杂交瘤细胞系的稳定性测定
• 2. 结果
• 2.1 间接ELISA方法的建立
• 2.1.1 抗原抗体工作浓度的确定
• 2.1.2 阴阳临界值的确定
• 2.2 免疫BALB/C小鼠血清效价测定
• 2.3 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3.1 饲养细胞、SP2/0细胞及脾细胞的制备
• 2.3.2 细胞融合
• 2.3.3 杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.3.4 单克隆抗体的大量制备
• 2.3.5 单克隆抗体的纯化
• 2.4 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性鉴定
• 2.4.1 杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体的ELISA效价测定
• 2.4.2 抗体亚型鉴定
• 2.4.3 Western blot分析结果
• 2.4.4 交叉反应性鉴定
• 2.4.5 杂交瘤细胞系的稳定性测定
• 3. 讨论
• 3.1 动物免疫
• 3.2 单克隆抗体的制备与鉴定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢