大鼠间充质干细胞磁标记及肝脏移植后的MR活体示踪

论文摘要

第一部分大鼠间充质干细胞的分离、培养及生物学特性目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离及体外扩增的方法，并了解其生物学特性，为应用MSCs进行进一步研究奠定基础。方法取Wistar大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔获得骨髓全系细胞，离心后重悬于含10％胎牛血清的5ml DMEM/F12培养基，置37℃、5％CO2饱合湿度培养箱中，利用贴壁法培养、纯化MSCs。接种后第3d全量换液，以后每2d换液1次，至贴壁细胞逐渐铺满瓶底时，传代扩增。倒置显微镜下观察细胞形态。分别取生长良好的P1、P3、P5代细胞绘制生长曲线，并进行贴壁率的检测。方差分析检验三代细胞生长性状及贴壁特性差异。结果（1）原代细胞生长较慢，以克隆集落方式增殖，培养早期细胞表现为短梭形、三角形或星形等多种形态。之后，细胞集落逐渐融合，细胞形态也渐趋均一，呈长梭形或纤维状。至第12～14d，细胞已基本融合，形态均一，呈成纤维细胞样生长。传代后细胞生长明显增快，形态及分布也更为均匀一致。（2）细胞生长曲线显示，第3d起细胞开始进入对数生长期，细胞倍增时间平均为28.1h，传代周期4～6d。P1、P3、P5代各时相细胞数之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）传代后细胞贴壁较快，4h约有60％的细胞贴壁，10h贴壁细胞已达90％以上。三代之间贴壁率差异无统计学意义（p＞0.05）。结论（1）采用贴壁法可达到分离、纯化MSCs的目的。（2）含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液适用于MSCs的体外培养、扩增。（3）大鼠骨髓MSCs体外培养表现为成纤维细胞样形态，贴壁及增殖性能良好，且多次传代后生长性状稳定，可作为进一步研究的理想细胞来源。第二部分应用超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠间充质干细胞目的探讨超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的可行性，优化标记方法，提高标记效率。方法菲立磁与多聚左旋赖氨酸（PLL）混悬（铁和PLL的终浓度分别为250ug/ml和7.5ug/ml）制备菲立磁—PLL复合物。将不同浓度的菲立磁—PLL复合物混合于培养基（铁的终浓度分别为150ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml和5ug/ml），加入MSCs，孵育过夜。分别于细胞标记后24h、1w、2w、3w、4w行普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒，原子吸收分光光度法测定细胞铁含量，台盼蓝排除试验检测细胞活性，并与未标记细胞或单纯菲立磁标记的细胞对照。所有数据以（?）±S表示，行方差分析，p＜0.05为有显著差异。结果菲立磁—PLL标记的细胞内可见较多蓝染颗粒，细胞标记率100％，单纯菲立磁标记的细胞内仅见少许细小蓝染颗粒。菲立磁—PLL标记组细胞铁含量显著高于单纯菲立磁标记组（p＜0.05），25ug/ml铁浓度标记的细胞铁含量明显高于10ug/ml及其以下浓度组（P＜0.05），但与50ug/ml及其以上浓度组差异无统计学意义（p＞0.05）。随细胞的分裂增殖，细胞内铁含量逐渐减少。台盼蓝排除试验显示100ug/ml及其以下浓度组磁标记干细胞的生长、增殖活力与未标记细胞之间差异无统计学意义（p＞0.05）。结论（1）应用菲立磁—PLL复合物标记大鼠间充质干细胞是可行的。（2）以25ug/ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高，而且对细胞生长及增殖活力无明显影响。（3）细胞铁含量与细胞的分裂增殖状态有关，细胞内铁可随传代进入子代细胞。第三部分磁标记大鼠间充质干细胞的体外MR成像目的探讨1.5 T临床应用型MR成像系统显示磁标记干细胞的可行性，了解磁标记干细胞的MR成像规律，并寻找MR成像的最佳序列和参数，为进一步磁标记干细胞体内移植的MR活体示踪奠定基础。方法（1）将1×103、1×104、1×106个磁标记干细胞悬于0.5ml明胶（10％）制备不同浓度细胞悬液，行MR成像。（2）1×106个细胞分别于标记后24h、1w、2w、3w、4w行MR成像，观察磁标记干细胞的动态信号变化。（3）MR成像方法及信号分析：1.5 T MR，SE T1WI（TR/TE=500ms/15ms）、SE T2WI（TR/TE=4000ms/100ms）、GRE T2*WI（300ms/20ms，flip angle=15°）序列，头线圈，层厚3mm，矩阵256×160，视野6～8cm×6～8cm。信号改变以下列公式计算：△SI=（（SIL-SIU）/SIU）×100％（△SI为信号变化率，SIL为标记细胞信号，SIU为未标记细胞信号）。（4）原子吸收分光光度法分别测定上述1×106个细胞各时相的铁含量。结果（1）1×103、1×104、1×105个磁标记干细胞在T1WI上信号改变率分别为（-4.93±1.99）％、（-9.90±1.95）％、（-15.87±3.05）％；T2WI信号改变率分别为（-67.93±2.94）％、（-78.77±1.37）％、（-88.73±1.12）％；T2*WI分别为（-72.50±5.96）％、（-82.90±2.72）％、（-92.60±1.01）％；T2WI和T2*WI显著高于T1WI（P＜0.05），其中以T2*WI更为明显。（2）1×105个磁标记细胞于24h、1w、2w、3w、4w的T2*WI信号降低率依次为（93.37±1.12）％、（65.52±0.92）％、（30.63±1.27）％、（13.63±0.96）％、（5.60±0.10）％，细胞铁含量依次为1.87±0.35ug、0.81±0.09ug、0.40+0.02ug、0.19±0.02ug、0.08+0.01ug，二者有显著相关（r=0.94，P＜0.05）。结论（1）在1.5T MR上，磁标记干细胞可引起明显的T2信号降低；（2）GRE T2*WI对显示磁标记干细胞最为敏感；（3）磁标记干细胞T2*信号降低程度与细胞数量有关。（4）T2*信号降低程度随细胞分裂增殖而逐渐降低。第四部分磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的MR活体示踪目的探讨1.5 T MR活体示踪磁标记干细胞经门静脉肝脏移植的可行性。方法Wistar大鼠30只，以2％CCl4灌喂法建立急性肝损伤模型，实验组和对照组分别为20只和10只。大鼠间充质干细胞行菲立磁和DAPI双重标记。将1×106个双标记干细胞经门静脉注射移植，对照组以同样方法注射等量未标记细胞。分别于细胞移植前及移植后1h、3d、7d和14d取4只实验组及2只对照组大鼠行MR扫描，并测量靶器官的信噪比。MR扫描：GRE T2*WI：TR/TE=300ms/20ms，flip angle=15°，表面线圈，层厚3mm，矩阵256×160，2～4次采集，视野6～8cm×6～8cm。动物于MR扫描后立即引颈处死，取肝脏、肾脏、肺和肌肉等组织，冰冻切片，每一标本相邻切面分别行荧光显微镜观察和普鲁士蓝染色。所有数据以（?）±S表示，行方差分析及t检验，p＜0.05为有显著差异。结果磁标记干细胞移植后1小时，肝脏信噪比为1.10±0.26，3d、7d及14d后信噪比分别为8.18±1.55，11.08±1.30，14.15±1.02，信号降低程度呈逐渐减弱趋势，移植后7d以内肝脏信噪比与移植前比较均有显著降低（p＜0.05）。实验组肾脏、肌肉以及对照组肝脏、肾脏、肌肉信噪比在移植前后差异无统计学意义（p＞0.05）。实验组磁标记干细胞移植后1h荧光显像及铁染色均较明显，以后逐渐减弱。各时相肝组织铁染色分布区域与荧光显微镜下荧光颗粒分布区域高度一致，并与MR信号降低程度一致。结论（1）磁标记干细胞经门脉肝脏移植后可引起明显的MR信号改变，1.5 T MR示踪时间可持续7d。（2）MR信号改变随移植时间而逐渐减弱。（3）MR信号改变程度与铁含量及荧光显像一致。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文
• 第一部分 大鼠间充质干细胞的分离、培养及生物学特性
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 应用超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠间充质干细胞
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 磁标记大鼠间充质干细胞的体外MR成像
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 第四部份 磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的MR活体示踪
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 综述一 干细胞磁标记及MR活体示踪
• 综述二 肝干细胞移植的研究进展
• 致谢
• 附录 攻读博士学位期间发表的论文