弧菌科细菌及鲶鱼爱德华氏菌密度感应系统的研究

论文摘要

密度感应（quorum sensing,QS）是指细菌用于细胞间交流的一种通讯机制,细菌通过分泌一些可在细胞间自由扩散的低分子量信号分子来协调菌群的行为。信号分子的浓度随着菌群数量的增加而增加,当信号分子的浓度达到一定阈值时,受密度感应调控的基因被激活,菌群中的细菌个体将共同调控某一种或一系列特定功能基因的表达,从而使菌群表现出某种群体性的行为,如产生荧光、分泌毒素等,因此密度感应又称群体感应。尽管最早的密度感应信号分子——酰基高丝氨酸内酯类分子是在费氏弧菌中（Vibrio fischeri）发现的,但至今对多数弧菌科细菌的密度感应系统还所知甚少。弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一,广泛分布于近岸及河口海水、海洋生物的体表和肠道中;有些种类的海洋弧菌是海水养殖业的重要致病菌,其毒力基因的表达往往通过密度感应系统控制。本研究中,我们主要检测了三种密度感应信号分子,即酰基高丝氨酸内酯类自诱导分子（acyl-homoserine lactone, AHLs）、AI-2类自诱导分子（autoinducer-2,AI-2）和霍乱弧菌Ⅰ类自诱导分子（cholerae autoinducer-1,CAI-1）在25株弧菌科细菌中的分布和多样性,并优化了检测CAI-1类信号分子的实验方法。实验结果显示,密度感应信号分子在弧菌科细菌中分布十分广泛,尤其是AHL和AI-2两类分子。除了肋生盐弧菌VIB288和需钠弧菌VIB299外,其它23株弧菌科细菌均能产生一种或多种信号分子。经两株报告菌株哈维氏弧菌JMH612和根癌农杆菌KYC55（pJZ372）（pJZ384）（pJZ410）检测,21株弧菌均能产生AHL信号分子。利用薄层层析法检测到其中8株菌的信号分子类型,其中地中海弧菌VIB296和火神别弧菌VIB414均能产生至少4种AHL信号分子。此外,20株弧菌科细菌具有AI-2类信号分子活性,本文通过PCR扩增得到18株细菌的luxS基因,测序后通过序列比对发现它们均含有两个保守基序,即His-Thr-Leu-Glu-His和[Gln/Lys]-Ile-Pro-[Glu/Asp]-Leu-Asn-Glu-Tyr序列,分别与LuxS保守基序的公式His-Xaa-Xaa-Glu-His和[Lys/Arg]-Xaa2-3-[Asp/Glu]-Xaa2-3-Tyr吻合,并且这些序列之间具有很高的相似性。本研究发现六株弧菌能产生CAI-I类信号分子。值得一提的是,火神别弧菌VIB414,坎贝氏弧菌VIB285,弗尼斯氏弧菌VIB293,伯麦罗氏弧菌LMG20537和两株哈维氏弧菌VIB571及VIB645均能产生三种类型的密度感应信号分子。鲶鱼爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）属于肠杆菌科,是一种能够引发鲶鱼肠败血症（ESC）的革兰氏阴性菌。从越南罹患鲶鱼肠败血症的斑纹鲶鱼中分离到一株病原菌,经16S rDNA测序及表型鉴定确定为一株鲶鱼爱德华氏菌。虽然与其同属的另一种病原菌——迟缓爱德华氏菌已被报道具有两类信号分子活性（AHL及AI-2）,但目前为止还没有关于鲶鱼爱德华氏菌密度感应系统的报道。本文利用不同的报告菌株检测了鲶鱼爱德华氏菌Ei-151的密度感应信号分子,结果表明,此菌至少能够产生三种AHL信号分子,且其AHL分子图谱与迟缓爱德华氏菌LTB-4的非常相似。基因背景的研究进一步支持上述实验结果,鲶鱼爱德华氏菌中假定AHL合成酶的基因序列[Genbank: YP002934276]及AHL识别蛋白的基因序列[Genbank: YP002934275]与迟缓爱德华氏菌中相应基因序列的相似性分别为93%和96%。Ei-151菌株在其整个生长周期均能够产生AHL信号分子及AI-2类信号分子,且两种信号分子的浓度均随着菌群密度的增加而增加,并在对数生长期时(OD600约为1.8)达到较高水平,然后呈现显著的降低,表明这两种信号分子介导的密度感应系统可能在该菌的基因调控方面同时发挥作用。此外,同迟缓爱德华氏菌一样,鲶鱼爱德华氏菌Ei-151及其标准菌株LMG7860T均未检测到CAI-I类信号分子活性。弧菌科细菌及鲶鱼爱德华氏菌均能产生多种复杂的密度感应信号分子,用来应对各种各样的环境因素及选择压力。本文的研究成果为进一步研究密度感应信号分子在这些细菌中所起的作用提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 水产养殖及其细菌性病害
• 1.1 世界和中国水产养殖概况
• 1.2 鱼类的细菌性病害
• 1.3 弧菌科细菌概述
• 2 弧菌科细菌的密度感应系统
• 2.1 密度感应系统的概述
• 2.2 费氏弧菌（V. fischeri）的密度感应系统
• 2.3 哈维氏弧菌（V. harveyi）的密度感应系统
• 2.4 霍乱弧菌（V. cholerae）的密度感应系统
• 2.5 创伤弧菌（V. vulnificus）的密度感应系统
• 2.6 鳗弧菌（V. anguillarum）的密度感应系统
• 3 密度感应信号分子的检测
• 3.1 酰基高丝氨酸内酯的检测
• 3.1.1 平板划线法
• 3.1.2 定量测定法
• 3.1.3 薄层层析结合生物报告菌株检测法
• 3.1.4 体内测定法
• 3.2 常用检测AHL 信号分子报告菌株的种类
• 3.2.1 检测中短链AHL 信号分子的报告菌株
• 3.2.2 检测长链AHL 信号分子的报告菌株
• 3.2.3 可以检测多种AHL 信号分子的报告菌株
• 3.2.4 检测3-羟基-AHL 信号分子的报告菌株
• 3.2.5 检测稀有AHL 信号分子的报告菌株
• 3.2.6 体内检测AHL 信号分子的报告菌株
• 3.3 AI-2 类信号分子的检测系统
• 3.4 CAI-1 类信号分子的检测系统
• 4 本论文的研究目的和意义
• 第二章 密度感应信号分子CAI-1检测方法的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基的配制
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 细菌上清液的制备
• 2.1.5 CAI-1 分子检测方法的优化
• 2.2 实验结果与分析
• 2.2.1 哈维氏弧菌的培养
• 2.2.2 阴性对照组的选择
• 2.2.3 报告菌株培养液稀释倍数的确定
• 2.2.4 优化的实验方法检测CAI-1 类信号分子
• 2.3 讨论
• 第三章 弧菌科细菌密度感应信号分子的检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基的配制
• 3.1.3 试剂和仪器
• 3.1.4 无菌上清液的制备
• 3.1.5 弧菌科细菌AHL 信号分子的检测
• 3.1.6 弧菌科细菌AI-2 类信号分子的检测
• 3.1.7 弧菌科细菌luxS 基因的克隆鉴定
• 3.1.8 弧菌科细菌luxS 基因的序列分析
• 3.1.9 弧菌科细菌CAI-1 类信号分子的检测
• 3.1.10 数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 弧菌科细菌AHL 信号分子的检测
• 3.2.2 弧菌科细菌AI-2 类信号分子的检测
• 3.2.3 弧菌科细菌luxS 基因的克隆鉴定
• 3.2.4 弧菌科细菌CAI-1 类信号分子的检测
• 3.3 讨论
• 第四章 鲶鱼爱德华氏菌密度感应系统的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基的配制
• 4.1.3 试剂和仪器
• 4.1.4 无菌上清液的制备
• 4.1.5 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 AHL 信号分子的检测
• 4.1.6 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 AI-2 类信号分子的检测
• 4.1.7 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 CAI-1 类信号分子的检测
• 4.1.8 数据处理
• 4.2 实验结果与分析
• 4.2.1 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 AHL 信号分子的检测
• 4.2.2 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 AI-2 信号分子的检测
• 4.2.3 鲶鱼爱德华氏菌Ei-151 CAI-1 类信号分子的检测
• 4.3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录I 溶液配方
• 致谢
• 个人简历
• 发表和撰写的文章