顺铂所致大鼠肾毒性机制及中药防治作用的研究

论文摘要

顺铂（Cisplatin DDP）是一种广泛应用的抗癌药物,在多种恶性肿瘤的治疗中取得了显著的疗效。但DDP有广泛的毒性,如肾毒性、血液毒性等。DDP对肾脏的毒性作用是临床应用受限制的主要因素。目前有关DDP肾毒性的研究较多,但DDP对于肾脏细胞凋亡、凋亡相关基因的表达、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（N0）及由肾脏产生和分泌的红细胞生成素（Epo）影响报道较少或尚未见报道。有报道,一些中药不仅具有抗肿瘤作用,在防治化疗药物毒副反应方面也具有独特的优势,目前,国内开展中医药防治抗癌药物毒副作用的研究已取得了一些成果,但尚未见中医药防治DDP诱发贫血的文献报道。为此,我们用DDP诱发大鼠肾毒性和贫血,探讨其产生的机制,并自拟益气健脾补肾中药,进行抑制或减轻DDP诱发肾毒性、贫血的实验研究,筛选出可提高Epo水平减轻DDP肾毒性及血液毒性的有效中药,以期为癌症化疗提供有效的辅助用药。如果该项目研究成功,将具有广泛的应用前景,预计将会有可观的经济效益和社会效益。本课题主要进行了以下几个方面的工作：1)DDP所致大鼠肾毒性机制的研究为了探讨细胞凋亡、凋亡相关基因表达、iNOS、N0在DDP肾毒性氧化应激机制中的作用,本研究给大鼠一次性尾静脉注射DDP8mg/kg诱发大鼠肾毒性,并于注射后第1、3、5、7天,检测大鼠肾皮质细胞凋亡,Bcl-2、Bax、P53基因蛋白表达,NO、丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）、铂（Pt）含量,iNOS、超氧化物歧化酶（SOD）活性,血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量,并观察肾组织在光镜、电镜下形态的变化。结果显示：DDP可诱发大鼠明显的肾毒性,血清Cr、BUN含量明显增加；DDP也可引起大鼠肾皮质细胞的凋亡率、Bax、P53基因蛋白表达量明显增加以及Bcl-2基因蛋白表达量明显下降,Bcl-2、Bax、P53基因蛋白表达与细胞凋亡具有显著的相关性；病理检查显示：DDP即可引起大鼠肾脏细胞凋亡,也可引起细胞坏死,结果表明：Bcl-2、Bax、P53基因是参与DDP诱导肾脏细胞凋亡的重要基因,细胞凋亡在DDP诱发肾毒性过程中起重要的作用。另一方面伴随DDP引起肾脏机能的减弱,DDP也可引起肾组织MDA、NO、Pt含量和iNOS活性增加以及GSH含量、SOD活性下降,结果表明：氧化损伤是DDP产生肾毒性的机制之一,由于N0与血清BUN、Cr的时相变化更为一致,表明N0在DDP所致的肾损害中起更主要的作用。2)益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠肾毒性的保护作用本研究的目的是探讨不同剂量益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠肾毒性的影响,给大鼠一次性尾静脉注射DDP8mg/kg,同时灌服不同剂量的益气健脾补肾中药（10.8g/kg/day,21.6g/kg/day,30.4g/kg/day）,检测大鼠血清BUN、Cr含量、肾皮质MDA、NO、Pt含量,iNOS、SOD的活性,同时观察中药复方对DDP抗肿瘤活性的影响,结果显示：中剂量益气健脾补肾中药能明显降低血清BUN、Cr的含量,减少肾组织MDA、N0含量及Pt蓄积,增加SOD活性,抑制iNOS活性,降低NO含量,减轻脂质过氧化程度,且对DDP的抗瘤活性没有影响。结果表明：适当剂量的益气健脾补肾中药对DDP所致大鼠的肾毒性具有明显的保护作用且不影响其抗瘤活性。3)DDP所致贫血大鼠血清Epo的变化在DDP诱发大鼠贫血过程中,血清Epo对贫血的反应有许多矛盾的报道。本研究通过同5-氟脲嘧啶（5-Fu）诱发大鼠贫血相比较,探讨DDP所致贫血大鼠血清Epo的变化以及与贫血的关系,给大鼠一次性尾静脉性注射DDP8mg/kg或5-Fu150mg/kg诱发大鼠贫血。于注射DDP或5-Fu后第7、21、35、49天检测大鼠血清Epo、BUN、全血血红蛋白（Hb）含量及网织红（Ret）数目,并同时观察肾组织在光镜、电镜下形态的变化。一次性尾静脉注射5-Fu可明显减少大鼠Ret数目、降低Hb浓度、升高血清Epo水平；5-Fu对大鼠血清BUN没有明显的影响,病理切片也没有发现明显的肾损害。一次性尾静脉注射DDP可明显降低大鼠Hb浓度,减少Ret数目,升高血清BUN水平。注射DDP后第7天,血清Epo水平明显下降,第21天明显升高,无论如何,血清Epo升高的水平是低的,病理切片也证实DDP可引起大鼠明显的肾损伤,结果表明：在5-Fu诱发大鼠贫血过程中,血清Epo的升高是对贫血的反馈反应。在DDP诱发大鼠贫血过程中,血清Epo升高的水平就其贫血程度来说是低的,DDP所诱发大鼠的肾毒性是血清Epo变化的主要原因。4)益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠贫血的影响本研究的目的是探讨不同剂量益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠贫血的影响。给大鼠一次性尾静脉注射DDP8mg/kg,同时灌服不同剂量的益气健脾补肾中药（10.8g/kg/day,21.6g/kg/day,30.4g/kg/day）,于注射DDP后第7、21、35、49天检测大鼠血清Epo、BUN、全血Hb的含量及Ret的数目,并同时观察肾组织在光镜、电镜下形态的变化。结果显示：中剂量益气健脾补肾中药能明显升高大鼠全血Hb、血清Epo的水平并使血清BUN含量明显降低,病理切片也证实中药对大鼠肾脏有明显的保护作用。结果表明：适当剂量的益气健脾补肾中药能有效拮抗DDP所致大鼠的肾损伤,减轻DDP对Epo产生的抑制作用,从而起到抑制DDP所致大鼠贫血的作用。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 DDP的应用

1.2 DDP肾毒性的发病机制

1.3 DDP肾毒性的防治作用

1.3.1 利尿剂

1.3.2 高渗盐水

1.3.3 微量元素

1.3.4 抗氧化剂

1.3.5 其它

1.4 Epo与DDP诱发的贫血

1.4.1 Epo的分子结构

1.4.2 Epo产生的部位

1.4.3 Epo生成的调节

1.4.4 Epo的生理功能

1.4.5 Epo与DDP诱发的贫血

1.5 本课题的主要研究内容

参考文献

第二章顺铂所致大鼠肾毒性机制的研究

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂和药品

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 实验动物的分组与处理

2.2.2 肾组织匀浆液的制备

2.2.3 流式细胞检测的样本制备及检测方法

2.2.4 生化指标测定

2.2.5 肾组织光,电镜标本的取材和制作

2.2.6 统计学处理

2.3 结果

2.3.1 血清BUN、Cr含量的变化

2.3.2 肾皮质MDA、GSH含量、SOD活性的变化

2.3.3 肾皮质iNOS活性、NO含量的变化

2.3.4 肾皮质Pt含量的变化

2.3.5 肾皮质细胞凋亡的变化

2.3.6 肾皮质Bcl-2、Bax、p53基因蛋白表达的变化

2.3.7 Bcl-2、Bax、p53基因蛋白表达与细胞凋亡的相关性

2.3.8 肾组织光镜形态学变化

2.3.9 肾组织电镜形态学变化

2.4 讨论

2.4.1 DDP对大鼠血清BUN、Cr的影响

2.4.2 DDP对大鼠肾皮质MDA、SOD、GSH的影响

2.4.3 DDP对大鼠肾皮质iNOS、NO的影响

2.4.4 DDP对大鼠肾皮质细胞凋亡的影响

2.4.5 DDP对大鼠肾脏凋亡相关基因蛋白表达的影响

2.4.6 氧自由基、NO与细胞凋亡关系的探讨

2.4.7 NO诱导凋亡可能的信号传递通路

2.5 小结

参考文献

第三章益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠肾损害的保护作用

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 瘤株

3.1.3 主要试剂和药品

3.1.4 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 实验动物分组与处理

3.2.2 肾组织均浆液的制备

3.2.3 样品的测定

3.2.4 益气补肾方药对DDP抗肿瘤作用的试验

3.2.5 统计学处理

3.3 结果分析

3.3.1 一般状况

3.3.2 各组大鼠体重的变化

3.3.3 各组大鼠血清BUN、Cr含量的变化

3.3.4 各组大鼠肾皮质MDA含量、SOD活性的变化

3.3.5 各组大鼠肾皮质NO含量、NOS活性的变化

3.3.6 各组大鼠肾脏系数及肾皮质铂含量的变化

3.3.7 益气健脾补肾中药对DDP抗瘤活性的影响

3.4 讨论

3.4.1 中医药增强放化疗药物的作用

3.4.2 化疗毒副反应的中医发病机制

3.4.3 益气健脾补肾方药防治DDP诱发大鼠肾毒性的效应和机制

3.4.4 益气健脾补肾方药防治DDP诱发肾毒性机制的综合评价

3.5 小结

参考文献

第四章顺铂所致大鼠贫血的机制及中药防护作用的实验研究

4.1 实验材料

4.1.1 动物

4.1.2 主要试剂和药品

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 实验动物分组和处理

4.2.2 测定方法

4.2.3 肾组织光,电镜标本的取材和制作

4.2.4 统计学处理

4.3 结果分析

4.3.1 顺铂诱发大鼠贫血机制研究实验结果分析

4.3.2 益气补肾中药对顺铂诱发大鼠贫血防护作用结果分析

4.4 讨论

4.4.1 DDP对大鼠红细胞生成素产生的影响

4.4.2 益气健脾补肾方药对DDP所致大鼠贫血的影响

4.5 小结

参考文献

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致谢

研究成果及发表的学术论文

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