三种氨基酸添加下酶法修饰酪蛋白水解物及其体外ACE抑制和抗氧化活性

论文摘要

高血压是引发心血管疾病如心力衰竭、中风、冠心病和心肌梗塞的重要危险因素。高血压在发病前是没有任何征兆的,所以它十分危险。据统计,全世界每年因高血压引发的心脑血管疾病而死亡的人数超过1200万,高血压已经成为人类健康的第一杀手,成为全球性的重大公共卫生问题。近年来的研究结果表明,酪蛋白除具有一定的营养功能之外还具有重要的生理功能,是生物活性肽的重要来源。其中食物蛋白源ACE抑制肽安全性高、副作用小、易吸收,已经成为活性肽领域研究热点,这些ACE抑制肽在开发具有降血压功能的食品中具有广阔的应用前景。本研究在添加外源性氨基酸的情况下对酪蛋白水解物进行类蛋白反应修饰,以期得到高活性的肽。利用Alcalase 2.4L FG蛋白酶水解酪蛋白,制备生物活性肽。酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高值出现的水解时间为6h,其相应的水解度为12.4%、IC50值为42.2μg/mL、DPPH自由基清除率为41.8%。酪蛋白水解物的ACE抑制活性和水解度之间有一定的关系:当酪蛋白水解物的水解度较低时,酪蛋白中具有ACE抑制活性的片段未被充分释放出来,导致酪蛋白水解物ACE抑制活性低;当酪蛋白水解物的水解度过高时,酪蛋白ACE抑制肽进一步酶解,从而失去它们的ACE抑制性。利用中心组合设计和响应面分析法,优化类蛋白反应条件。固定酪蛋白水解物的浓度为35%（m/m）,反应时间为6 h,以反应体系中游离氨基减少量为响应值,考察氨基酸添加量、酶添加量、反应温度及3种外源性氨基酸对类蛋白反应程度的影响。研究发现:（1）氨基酸添加量、反应温度、氨基酸种类对类蛋白反应的影响显著,而酶添加量对类蛋白反应的影响不大。（2）在分别添加亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸后,同样研究反应条件对酪蛋白水解物进行类蛋白反应的影响,发现所得到研究结果是相似的。得到在3种外源性氨基酸添加下酪蛋白水解物类蛋白反应的最适反应条件为:氨基酸添加量0.6 mol/mol、酶添加量3 kU/g蛋白、反应温度40℃;（3）对类蛋白反应影响的最主要因素为氨基酸添加量、反应温度。分别添加苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸于酪蛋白水解物进行类蛋白反应,制备3个酪蛋白水解物的修饰产物,并测定它们的ACE抑制活性、IC50值和抗氧化活性。结果表明,酪蛋白水解物的ACE抑制活性随修饰程度的增加而提高,并且都高于未经修饰的酪蛋白水解物,其IC50降低至21.025.1μg/mL,表明添加外源氨基酸可提高修饰产物的ACE抑制活性,但添加不同种氨基酸的影响不显著。类蛋白反应修饰后,产物的抗氧化活性明显提高,且远高于酪蛋白水解物。添加不同种外源性氨基酸对抗氧化活性的影响不同:添加苯丙氨酸的修饰产物的DPPH和还原能力最高,添加亮氨酸的修饰产物羟自由基清除活性最高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 酪蛋白概况
• 1.1.1 酪蛋白的组成
• 1.1.2 酪蛋白的应用
• 1.2 生物活性肽的研究进展
• 1.2.1 生物活性肽的概况
• 1.2.2 生物活性肽的吸收机制
• 1.2.3 生物活性肽的功能
• 1.2.4 生物活性肽的制备
• 1.3 ACE 抑制肽
• 1.3.1 ACE 对血压的调节作用
• 1.3.2 ACE 抑制肽的构效关系
• 1.3.3 ACE 抑制肽的制备
• 1.3.4 食品源ACE 抑制肽
• 1.4 抗氧化肽
• 1.4.1 自由基对人体的伤害
• 1.4.2 抗氧化肽的来源
• 1.5 类蛋白反应
• 1.5.1 反应机理
• 1.5.2 应用
• 1.6 研究目的和意义
• 1.7 研究的主要内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 原料与试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 酪蛋白水解物的制备
• 2.2.2 酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰
• 2.2.3 相关分析
• 3 结果与分析
• 3.1 技术路线
• 3.2 酪蛋白水解物的制备
• 3.2.1 蛋白酶活力的测定
• 3.2.2 游离氨基测定
• 3.2.3 酪蛋白水解物的制备
• 3.3 类蛋白反应条件的优化
• 3.3.1 回归方程的建立与分析
• 3.3.2 添加亮氨酸对类蛋白反应的影响
• 3.3.3 添加苯丙氨酸对类蛋白反应的影响
• 3.3.4 修饰产物的ACE 抑制活性及抗氧化活性
• 4 讨论
• 4.1 酪蛋白水解物的制备
• 4.2 类蛋白反应修饰条件的优化
• 4.3 ACE 活性及抗氧化活性的分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文