禾谷镰刀菌类群、转抗体融合蛋白小麦及转抗菌肽水稻的研究

论文摘要

由禾谷镰刀菌引起的小麦、玉米赤霉病,不仅降低作物产量,更重要的是病菌在侵染过程中产生的毒素,直接累积存留在谷类籽粒中,危害人、畜健康;我国赤霉病发生面积大、各病区农业生态环境差异悬殊,然而却没有关于我国禾谷镰刀菌种群、毒素化学型及其地理分布的系统研究;同时由于抗赤霉病资源匮乏,在小麦及其近缘物种中没有发现免疫或高抗赤霉病的资源,导致抗赤霉病育种长期徘徊不前。因此,利用从全国各赤霉病区收集的菌株,分析其系统群及毒素类型;在小麦中表达鉴定抗体融合蛋白的抗赤霉病性,对于鉴定分析抗赤霉病品种、降低镰刀菌毒素危害、保证食品安全、培育高抗赤霉病品种具有重要意义。而在水稻中,稻瘟病和纹枯病每年造成巨大损失,因此鉴定表达多基因的水稻对稻瘟病和纹枯病的抗性,对培育稻瘟病及纹枯病品种具有重要意义。本论文围绕赤霉病菌、抗赤霉病性和抗稻真菌病性改良,开展了三个方面的研究:（1）禾谷镰刀菌的系统群及产毒类型分析;（2）转镰刀菌特异抗体融合蛋白小麦的分析与鉴定;（3）转抗菌肽水稻的分析与鉴定。主要研究结果如下:1.以禾谷镰刀菌特异引物Fg16F/R,分析鉴定了来自我国13省（市）的小麦、玉米禾谷镰刀菌菌株460份,发现我国的禾谷镰刀菌群（Fusarium graminearum clade）可以分为两种类型:SCARⅠ型和SCARⅤ型。从两种类型中随机选择来源不同的30个菌株,序列测定其镰刀菌毒素解毒酶基因（Tri101）、类还原酶基因（reductase-likegene）和组蛋白（Histone 3）基因,根据国际最新种群分类法中确定的固定核苷酸序列,分析、比较了这三个基因序列及其特点,结果表明,我国禾谷镰刀菌群中存在两种类群,即亚洲型（Fusarium asiaticum）和禾谷型（Fusarium graminearum）。这两种类群与SCAR类型完全一致,即SCARⅠ型属于禾谷型,SCARⅤ型为亚洲型。这是首列禾谷镰刀菌群系统群与SCAR类型完全一致的报道。在所分析的460个菌株中,342株为亚洲型,118株为禾谷型,因此亚洲型菌株是我国目前禾谷镰刀菌群的优势种类。结合我国赤霉病流行地区30年（1970年～1999年）年均温度资料分析表明,亚洲型菌株主要分布在年均温度高于15℃的长江流域及以南一带,而禾谷型菌株则主要来分布于年均温度15℃或更低的东北、黄河流域等地区。因此就优势菌种地域分布而言,禾谷型菌株是我国年均温度较低地区的优势菌种,亚洲型菌株为我国温暖地区的优势菌种。2.根据禾谷镰刀菌毒素代谢路径关键基因（Tri5-Tri6、Tri3-Tri8、Tri7、Tri3）保守序列,设计多对毒素化学型鉴定引物,通过一系列不同PCR,鉴定了来自我国13个省（市）342株禾谷镰刀菌群的毒素化学型。结果表明,我国禾谷镰刀菌群存在三种毒素化学型,其中3-AcDON型176株,占51.46%;15-AcDON型113株,占33.04%;NIV型53株,占15.50%;同时,我国存在两种不同的15-AcDON型菌株,在Tri7基因中存在11 bp重复序列的为禾谷型,没有该重复序列的属于亚洲型,这种类型迄今未见文献报道,我们将其暂定为新15-AcDON毒素型。这些研究结果还表明,这个11 bp重复序列可以作为鉴别15-AcDON型菌株为禾谷型或亚洲型的分子标记。3.以基因枪法转化小麦未成熟胚,首次将镰刀菌特异抗体—抗菌肽融合蛋白转入小麦,经除草剂筛选获得15株阳性再生植株。将T1代植株种植后,在开花期单花接种赤霉病菌,于接种后7d、14d、21d调查病情指数。结果表明,接种21天后仍有7个抗性显著提高的单株,PCR和RT-PCR分析表明这些抗病植株整合和表达了抗体融合蛋白基因。进一步对这7个单株的T2代接种赤霉病菌,鉴定获得6个抗性显著提高的转基因株系,其抗扩展性与目前最好的抗病品种苏麦3号相当。因此,镰刀菌特异抗体-抗菌肽融合蛋白介导的抗赤霉病性,能够稳定遗传,可作为优良抗赤霉病新基因,用于小麦分子育种,提高小麦的抗赤霉病性。4.利用基因枪法转化水稻成熟胚,将小麦几丁质酶基因（Chi）、曲霉抗菌肽基因（AG）、玉米抗菌肽基因（MBP）与潮霉素标记（Hyg）同时转入水稻。经潮霉素筛选、PCR分析鉴定出36个转基因株系,其中17个含有三个目的基因的转基因株系,Southern blot和Western blot分析证实了目的基因的整合及表达。对T2代植株抗稻瘟病性和抗纹枯病性的接种鉴定表明,6个株系兼抗稻瘟病和抗纹枯病,两种抗性均达到中抗以上水平,这些结果说明多基因共表达可改良植株的抗病性状。同时,PCR及Southern blot分析证实,在T2代株系中分离出不含潮霉素标记基因、但含有目的基因的抗病株系,说明将抗性标记基因和目的基因分别构建在不同载体后共转化植株,可以获得不含抗性标记的转基因植株,为进一步筛选无抗生素标记转基因水稻打下了基础。

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摘要

Abstract

缩略词表

文献综述

1 小麦赤霉病菌禾谷镰刀菌分类进展

1.1 赤霉病的危害和病原菌种类

1.2 禾谷镰刀菌种群划分

1.2.1 与致病性相关类型的划分

1.2.2 禾谷镰刀菌分类体系的发展

1.3 禾谷镰刀菌毒素

1.3.1 禾谷镰刀菌毒素类型

1.3.2 单端孢霉烯族毒素的分子生物学研究

1.3.3 禾谷镰刀菌毒素的危害

1.3.3.1 禾谷镰刀菌毒素对植物的致病作用

1.3.3.2 禾谷镰刀菌毒素对人畜的危害

1.3.4 禾谷镰刀菌毒素检测方法

1.3.4.1 定量检测

1.3.4.1.1 生物检测法

1.3.4.1.2 化学检测法

1.3.4.1.3 免疫化学检测法

1.3.4.2 定性检测

2 植物抗病性研究

2.1 植物抗病机制

2.2 与植物抗病相关基因的种类

2.2.1 植物本身的抗病基因

2.2.2 防卫基因

2.2.3 其它抗病基因

3 禾谷类植物基因转化技术

3.1 原生质体遗传转化

3.2 基因枪法遗传转化

3.3 根癌农杆菌介导的遗传转化

3.4 花粉管通道法遗传转化

4 小麦抗病基因工程

4.1 小麦转基因研究概况

4.2 小麦抗赤霉病育种基因工程

4.2.1 小麦抗赤霉病的抗源筛选

4.2.2 小麦赤霉病抗性遗传分析及抗性基因QTL定位

4.2.3 小麦抗赤霉病相关基因的应用

4.2.3.1 防卫反应相关的蛋白基因的应用

4.2.3.2 赤霉病菌毒素合成基因的应用

4.2.3.3 防卫反应信号传导途径中的一些调控基因应用

4.2.3.4 镰刀菌特异抗体介导的融合蛋白基因的应用

5 水稻抗病基因工程

5.1 抗病毒基因工程

5.2 抗细菌基因工程

5.3 水稻抗真菌病害基因工程

第一章禾谷镰刀菌的系统群及毒素化学型分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 各种培养基、试剂及试剂盒

2.2 方法

2.2.1 禾谷镰刀菌分离和纯化

2.2.2 菌丝培养及基因组DNA提取

2.2.3 禾谷镰刀菌SCAR类型鉴定

2.2.4 禾谷镰刀菌系统进化种群鉴定

2.2.4.1 3个基因部分序列的克隆测序

2.2.4.2 镰刀菌类群鉴定

2.2.5 禾谷镰刀菌毒素化学型分析

2.2.5.1 DON和NIV毒素化学型鉴定

2.2.5.2 DON毒素衍生物产生菌鉴定

2.2.5.3 Tri7基因片段克隆与序列分析

3 结果与分析

3.1 禾谷镰刀菌的形态鉴定

3.2 禾谷镰刀菌的SCAR类型鉴定

3.3 禾谷镰刀菌系统进化类群分析

3.4 禾谷型和亚洲型禾谷镰刀菌的地理分布

3.5 禾谷镰刀菌毒素化学型鉴定

3.5.1 DON和NIV毒素化学型鉴定

3.5.2 DON毒素衍生物产生菌分析鉴定

3.6 禾谷镰刀菌Tri7基因的多样性分析

4 讨论

4.1 禾谷镰刀菌系统进化类群和地理分布的关系

4.2 禾谷镰刀菌毒素化学型分类

4.3 禾谷镰刀菌系统进化类群和毒素化学型分类的关系

4.4 新15-AcDON型菌株的发现

第二章转镰刀菌特异抗体融合蛋白小麦的分析与鉴定

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料及试剂

2.2 方法

2.2.1 小麦愈伤的培养

2.2.2 基因枪介导的小麦转化

2.2.2.1 微弹制备

2.2.2.2 金粉-DNA的包裹

2.2.2.3 基因枪轰击小麦愈伤

2.2.3 转基因小麦植株的获得

2.2.4 转基因植株的PCR检测

2.2.4.1 小麦基因组DNA提取

2.2.4.2 转基因小麦的PCR检测

2.2.5 转基因植株的抗赤霉病性检测

2.2.5.1 供试菌株的培养与分生孢子液的制备

2.2.5.2 田间抗病性鉴定

2.2.5.2.1 接种方法

2.2.5.2.2 调查方法

2.2.6 转基因植株的RT-PCR检测

2.2.6.1 叶片总RNA抽提步骤

2.2.6.2 总RNA中基因组DNA的消除

2.2.6.3 cDNA第一链的合成

2.2.6.4 PCR扩增

3 结果与分析

3.1 转基因小麦的获得

3.2 转基因小麦T0代的PCR检测

3.3 转基因小麦T1代抗赤霉病性筛选

3.4 转基因小麦T1代PCR检测

3.5 转基因小麦T1代RT-PCR检测

3.6 转基因小麦T2代抗赤霉病性鉴定

4 讨论

第三章转抗菌肽水稻的分析与鉴定

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料及试剂

2.2 方法

2.2.1 水稻愈伤诱导培养

2.2.2 基因枪介导的水稻转化

2.2.2.1 微弹制备及金粉-包裹

2.2.2.2 基因枪轰击水稻愈伤

2.2.3 转基因水稻植株的获得

2.2.4 转基因植株的PCR检测

2.2.4.1 水稻基因组DNA提取

2.2.4.2 转基因水稻的PCR反应

2.2.5 转基因植株的Western blot分析

2.2.5.1 水稻总蛋白提取

2.2.5.2 SDS-PAGE电泳检测

2.2.5.3 Western blot分析

2.2.5 转基因植株的Southern blot分析

2.2.5.1 水稻基因组DNA的酶切

2.2.5.2 碱性条件下DNA向尼龙膜的毛细管转移

2.2.5.3 探针制备

2.2.6.4 预杂交

2.2.5.4 探针的标记

2.2.5.5 杂交、洗膜及放射自显影

2.2.6 转基因水稻的抗稻瘟病性鉴定

2.2.6.1 供试菌株的培养与筛选

2.2.6.2 接种鉴定方法

2.2.6.3 染色显微观察

2.2.7 转基因水稻的抗纹枯病性鉴定

3 结果与分析

3.1 转基因水稻筛选

3.2 转抗菌肽水稻T1代PCR检测

3.3 转抗菌肽水稻T1代Western blot检测

3.4 转抗菌肽水稻T2代PCR检测

3.5 转抗菌肽水稻T2代Southern blot分析

3.6 转抗菌肽水稻T2代抗稻瘟病性鉴定

3.6.1 供试菌株的筛选

3.6.2 转抗菌肽水稻的抗稻瘟病性鉴定

3.7 转抗菌肽水稻T2代抗纹枯病性鉴定

4 讨论

4.1 多基因共转化植株的筛选

4.2 转抗菌肽水稻的抗病性

4.3 多基因共转化中无抗生素标记基因植株的获得

参考文献

致谢

附录A:各种培养基、溶液及试剂的配制

附录B:博士在读期间已发表或已接受的文章

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