Valsartan、Fluvastatin对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞PDGF、VEGF表达影响的研究

论文摘要

目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy , DN）在西方发达国家已成为终末期肾衰竭的首位原因。近年来,我国糖尿病发病率逐年上升,DN患者也随之增加,其防治是当前肾脏病学者密切关注的课题。DN的确切发病机制尚不十分清楚。肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cell , GMC）是肾小球中最活跃的细胞,对于维持肾脏正常组织结构和生理功能发挥着重要作用,多种肾脏疾病表现出GMC的功能异常。近年基础研究发现转化生长因子β（Transforming growth factors-β, TGF-β）、血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor , PDGF）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor , VEGF）等可促进细胞增殖及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）分泌,而DN早期主要是GMC增殖肥大和ECM积聚。已有研究证实TGF-β参与了DN整个病理过程,而进一步探讨PDGF和VEGF与GMC增殖及ECM分泌的关系,有望更加深入揭示DN的发病机制。高血糖是糖尿病血管并发症（包括DN）发展的高危因素之一,晚近国外研究报道高糖刺激可通过蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）等途径激活丝裂原蛋白激酶家族（MAPKs）的一些成员。MAPK也被称为胞外信号调节激酶（extra cellular signal regulated kinase, ERK）,属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,是细胞内介导胞外刺激的信号通路之一,哺乳动物细胞内存在胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、C-jun氨基末端激酶（JNK）、P38MAPK和胞外信号调节激酶5（ERK5）。在不同胞外刺激下,相应的MAPK通路激活,从而使细胞对各种各样的胞外刺激作出反应。有研究证实激素和生长因子等可通过Ras依赖的信号通路激活MAPK,然后磷酸化转录因子,促进一些生长反应基因PDGF、VEGF等的mRNA在MC的异常表达,最后引起细胞的增殖和分化,但机制目前尚未完全阐明。此外,高糖环境GMC自分泌多种生长因子和细胞活素,如TGF-β、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）等的表达异常也有可能通过某些通路刺激VEGF、PDGF的表达异常。PDGF和VEGF都属于促生长因子,与组织细胞生长发育有关。PDGF是一种主要由血小板分泌产生的重要促细胞生长因子,VEGF是一种主要作用于血管内皮细胞的丝裂原。有文献报道,GMC能合成分泌这两种细胞因子,并且存在这两种细胞因子的受体。在糖尿病（diabetes mellitus, DM）患者和动物模型中,免疫组化研究证实PDGF、VEGF在系膜区表达增多,而高血糖是DM最基本的生化特性,提示高糖有可能诱导两种因子在GMC的异常表达进而通过作用于GMC特异性受体发挥生物学效应并参与DN发生发展。血管紧张素受体拮抗剂（AT1Ra）在临床高血压的治疗当中被广泛应用,其主要通过阻止血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与其受体AT1结合,抑制了AngⅡ的生物学作用。有文献报道高糖培养的GMC可自分泌AngⅡ,后者和GMC膜上AT1结合,进而导致了GMC内PKC等通路的活化,引起其他生长因子基因和蛋白的异常表达,最终使GMC增殖和分化。HMG-CoA还原酶抑制剂（HRI）,是经典有效的降脂药物,晚近研究提示,HRI可能具有非降脂相关的肾保护作用。HRI可通过抑制甲羟戊酸代谢产物FPP、GGpp的合成使依赖其修饰的小GTP蛋白Ras不能定位于细胞膜,从而抑制细胞内信号传导。利用AT1Ra Valsartan和HRI Fluvastatin进行干预,观察PDGF、VEGF在高糖培养GMC的表达及药物的保护作用能为阐明DN的发病机制及寻找防治方法提供实验性理论依据。方法:SD大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）,购于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。贴壁细胞常规培养,待细胞融合后, 0. 25%胰酶/ 0. 02%EDTA消化传代,应用倒置显微镜观察各时期细胞形态;待细胞生长达到一定数量后,将其随机分为五组:即正常对照组（D-葡萄糖5. 5mmol/L,NG组）、甘露醇组（D-葡萄糖5. 5mmol/L+甘露醇24. 5mmol/L,MG组）、高糖组（D-葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖+Valsartan干预组（D-葡萄糖30mmol/L+缬沙坦10μmol/L,HG+val）和高糖+Fluvastatin干预组（D-葡萄糖30 mmol/L +Fluvastatin 10μmol/L,HG+flu组）分别培养。五组于实验开始后3、6、24、48、72h收集细胞,用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测GMC中PDGF、VEGF mRNA的表达,用western blot法检测各实验组GMC中PDGF、VEGF蛋白的表达,用ELISA法测定各组细胞上清ECM中IV型胶原（collegen type IV）、层粘连蛋白（laminin , LN）和纤维连接蛋白（fibronectin, FN）的含量。结果:1细胞培养结果:倒置相差显微镜下可见MC呈梭形、不规则星形或三角形、树枝形,当细胞密集时可重叠生长,胞浆多突起,有大量微丝样结构,核居中央,多呈圆形或椭圆形;2 RT-PCR、western blot结果显示:高糖环境中GMC PDGF mRNA和蛋白水平24h时较NG组升高（P<0. 01）,且随时间延长表达量有增高趋势（P<0. 01）,药物干预后上述指标较HG组表达水平下降（P<0. 01）;同时间点MG组PDGF mRNA和蛋白水平也较NG组升高(（P<0. 01）;高糖环境VEGF mRNA和蛋白水平在3h时明显高于NG组（P<0. 01）,后逐渐降低,24h时后于NG组无差别（P>0. 05）,药物干预后上述指标较HG组表达水平下降（P<0. 01）,同时间点MG组VEGF mRNA和蛋白于NG组无差别（P>0. 05）;3 ELISA结果: 3h、6h、24h HG组Ⅳ型胶原（除外24h P<0. 05）、LN、FN含量与NG组无显著差别（P>0. 05）,48h时HG组Ⅳ型胶原、LN、FN含量较NG组增高（P<0. 01,P<0. 01, P<0. 05）,且随时间延长表达量有增高趋势,药物干预后上述指标较HG组表达水平下降（P<0. 01）;MG组较NG组无显著差异（P>0. 05）。结论:上述结果提示高糖环境GMC异常表达PDGF、VEGF及ECM可能参与了糖尿病肾损害的发生、发展过程;这些异常表达可能与肾脏细胞内的一些信号转导通路（如:MAPK等）激活有关。Valsartan、Fluvastatin可抑制高糖刺激下GMC中一些通路（如:MAPK等）的活化,进而下调PDGF、VEGF,抑制Ⅳ型胶原、FN和LN的合成与分泌提示Valsartan、Fluvastatin对肾脏的直接保护作用机制可能部分通过抑制系膜细胞内一些通路的激活而完成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 Valsartan、Fluvastatin 对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞PDGF、VEGF 表达影响的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 肾脏疾病中血管内皮生长因子的研究进展
• 致谢
• 个人简历