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有机肥中抗生素及其抗性基因的检测和恩诺沙星对生菜内生细菌的喹诺酮抗性基因的影响

2020-12-29阅读(758)

有机肥中抗生素及其抗性基因的检测和恩诺沙星对生菜内生细菌的喹诺酮抗性基因的影响

论文摘要

在集约化畜禽养殖业中,抗生素不仅用于治疗和预防动物疾病,还被用作动物生长促进剂添加在饲料中,导致养殖场的畜禽粪便中含有大量抗生素残留。养殖业产生的粪肥经处理后,常被用作绿色有机肥用于改良土壤、提高作物产量和品质。由于我国现行的有机肥标准并未将抗生素残留指标列入,有机肥中抗生素的残留状况仍不清楚。有机肥中所含的抗生素及抗生素抗性基因向土壤环境中释放和迁移,导致产生新的环境问题。另外,近几年来一些文献报道植物内生细菌含有多重抗生素抗性,其抗生素抗性基因的来源和产生机制仍不清楚。本文对南京市销售的商品有机肥中的抗生素残留和抗生素抗性基因进行了检测；在土壤中添加抗生素,检测土壤中和在其上盆栽的生菜中抗生素及抗生素抗性基因的变化并分析两者之间的相关性。本研究对研究抗生素及其抗性基因在环境中,特别是食物链中的迁移变化规律有重要价值。对南京市8种商品有机肥中的18种兽药抗生素和相关抗生素抗性基因进行检测。除磺胺类抗生素、金霉素和泰乐菌素,其他抗生素均有不同程度的检出。其中恩诺沙星、四环素和罗红霉素在所测8种有机肥中均有检出,恩诺沙星的检出浓度为24.3～225.5μg·kg-1,四环素为13.9～92.4μg·kg-1,罗红霉素为13.6-32.6μg·kg-1；环丙沙星和氧氟沙星的检出率均为75%,检出浓度分别为33.6141.0μg·kg-1,12.9～360.6μg·kg-1；诺氟沙星、土霉素、强力霉素和红霉素的检出率分别为62.5%,50%,37.5%,25%,检出浓度分别为12.2～111.9μg·kg-1, 24.2～231.6μg·kg-1,21.4～403.2μg·kg-1和8.9～33.4μg·kg-1。.在四环素抗性基因的检测中,除tetT外,其他四种抗性基因均有检出；五种喹诺酮抗性基因均有检出。其中,aac（6’）-Ib、tetW两种抗性基因在8种有机肥中都检测出来,qnrA、qnrB和tetO的检出率也达到75%以上。所测有机肥中含有大量的兽药抗生素残留,其中氟喹诺酮类和四环素类抗生素的检出率和残留量很高,这两类抗生素的抗性基因的检出率也很高。目前抗性素抗性基因作为一类新型环境染物,其在有机肥中大量存在,随着有机肥的施用可能会对食物链造成二次污染。在土壤中添加不同浓度恩诺沙星后,检测盆栽生菜中抗生素的残留和喹诺酮抗性基因qnrA和qnrB的丰度变化及其与土壤中qnrA和qnrB的丰度变化之间的相关性。结果显示,生菜中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星与土壤中的残留水平呈正相关性,生菜对于土壤恩诺沙星的吸收比例约为0.6%；qnrA和qnrB在生菜和土壤中均有检测,在0～50 mg·kg-1的土壤抗生素浓度范围内,两者的丰度均呈现不同程度的增加。其中qnrA/16S rDNA在土壤中的变化由1.08×10-4至1.66×10一,增加1.54倍;造成的生菜中qnrA/16S rDNA变化由3.38×10-4至7.63×10一,增加2.26倍。qnrB在土壤中丰度变化明显,qnrB/16S rDNA的变化由4.0×10-4至1.16×10-3,增加2.9倍;造成的生菜中qnrB/16S rDNA的变化由3.35×10-3至1.09×10-2,增加3.25倍。结果表明土壤中添加抗生素可造成土壤中和生菜中抗生素抗性基因丰度的增加,生菜中的抗生素抗性基因同土壤中呈相关性。本文还进行了生菜可培养内生细菌分离和鉴定,共得到31株菌。其中革兰氏阳性菌为22株,占总菌数的71%；菌株分属于包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、细杆菌属和节杆菌属在内的11个属,其中芽孢杆菌为10株,占总菌数的32.1%。对内生细菌进行的抗生素药敏试验显示,有6株细菌表现出对氟喹诺酮类药物的耐药性,分属于假单胞菌属、细杆菌属和节杆菌属,且同属菌株之间表现出相似的耐药性。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩写
  • 第一章 前言
  • 一、环境中的抗生素
  • 二、新型环境污染物—抗生素抗性基因
  • （一） ARGs储存库的形成
  • （二） ARGs的传播扩散途径
  • 三、喹诺酮类抗生素概述
  • （一） 喹诺酮类抗生素的分类
  • （二） 喹诺酮类抗生素的作用机制
  • （三） 喹诺酮类抗生素的使用
  • 四、质粒介导的喹诺酮抗性基因
  • （一） PMQR基因的分类及其耐药机制
  • （二） PMQR基因的流行
  • 五、有机肥源抗生素污染的研究
  • 六、抗生素和ARGs向植物传播的研究
  • 七、本论文的研究思路
  • 第二章 有机肥中典型抗生素残留测定及相关ARGs检测
  • 1 实验材料
  • 1.1 供试材料
  • 1.2 药品试剂
  • 1.3 仪器设备
  • 1.4 溶液及培养基配制
  • 1.5 酶及引物
  • 1.6 其他材料
  • 1.7 菌株培养与保藏
  • 2 实验方法
  • 2.1 有机肥中四类典型抗生素残留的同时测定
  • 2.1.1 样品前处理
  • 2.1.2 UPLC-MS/MS检测
  • 2.2 有机肥DNA的提取及抗性基因检测
  • 2.2.1 有机肥DNA的提取
  • 2.2.2 ARGs检测
  • 3 结果与分析
  • 3.1 有机肥中抗生素的检测
  • 3.1.1 线性方程和检出限
  • 3.1.2 南京市售有机肥中4类抗生素检测
  • 3.2 有机肥DNA提取及ARGs测定
  • 3.2.1 有机肥DNA提取方法的优化
  • 3.2.2 ARGs的检测
  • 4 讨论
  • 第三章 土壤中添加思诺沙星对生菜内生细菌抗性基因qnrA、qnrB的影响
  • 第一节 PMQR基因阳性克隆构建与qPCR方法的建立
  • 1 实验材料
  • 1.1 菌种和质粒
  • 1.2 药品试剂
  • 1.3 仪器设备
  • 1.4 溶液和培养基配制
  • 1.5 酶及引物
  • 1.6 其他材料
  • 1.7 菌株培养与保藏
  • 2 实验方法
  • 2.1 阳性克隆的构建
  • 2.1.1 目的DNA的扩增
  • 2.1.2 PCR产物纯化回收
  • 2.1.3 PCR产物装TA克隆
  • 2.1.4 感受态细胞制备及转化
  • 2.1.5 阳性克隆的筛选及双酶切验证
  • 2.1.6 PCR扩增与测序验证
  • 2.2 荧光实时定量PCR反应
  • 2.2.1 qPCR方法
  • 2.2.2 qPCR标准曲线
  • 3 结果与分析
  • 3.1 阳性克隆的筛选
  • 3.2 qPCR方法
  • 第二节 生菜盆栽试验及相关数据测定
  • 1 实验材料
  • 1.1 供试材料
  • 1.2 药品试剂
  • 1.3 仪器设备
  • 1.4 溶液及培养基配制
  • 1.5 酶及引物
  • 1.6 其他材料
  • 1.7 菌株培养与保藏
  • 2 实验方法
  • 2.1 实验设计
  • 2.2 化学分析方法
  • 2.2.1 土壤中恩诺沙星及环丙沙星的提取
  • 2.2.2 生菜中恩诺沙星及环丙沙星的提取
  • 2.2.3 UPLC-MS/MS检测
  • 2.3 抗性基因的定量
  • 2.3.1 土壤DNA的提取
  • 2.3.2 生菜叶片内生细菌的富集及DNA的提取
  • 2.3.3 qPCR定量
  • 2.4 内生细菌的分离和鉴定
  • 2.4.1 内生细菌分离
  • 2.4.2 内生细菌菌种鉴定
  • 2.4.3 抗生素敏感性实验
  • 2.5 数据统计和分析
  • 3 结果与分析
  • 3.1 土壤和生菜中的恩诺沙星及环丙沙星
  • 3.1.1 检测限与定量限
  • 3.1.2 检测结果
  • 3.2 土壤和生菜叶片内生细菌的PMQR基因的定量检测
  • 3.2.1 qPCR引物
  • 3.2.2 qPCR检测限
  • 3.2.3 检测结果
  • 3.3 生菜内生细菌菌种鉴定和耐药性
  • 3.3.1 内生细菌计数
  • 3.3.2 菌种鉴定
  • 3.3.3 药敏试验
  • 3.3.4 耐药性细菌的PMQR基因扩增
  • 4 讨论
  • 参考文献
  • 创新和不足之处
  • 致谢
  • 附件

    • 相关论文文献

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