牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR分型检测方法的建立及初步应用的研究

论文摘要

牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD）,简称牛病毒性腹泻（BVD）,是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染牛引起的以发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、持续性感染与免疫耐受及怀孕母牛流产、产死胎和畸形胎等为主要特征的一种传染病。牛病毒性腹泻病毒在世界各国普遍存在,给畜牧业造成了巨大的经济损失。目前,国内已有20多个省、市、自治区报道存在BVDV感染。BVDV的检测方法大体分为血清学检测和病原学检测两种,以病原诊断为主,通常联合使用可获得理想效果。本研究从病原诊断入手,利用分子生物软件比对Genbank上已发表的BVDV全基因组序列,同时参考已发表文献,分别在基因组5’UTR和非结构蛋白NS5B两处基因相对保守区,设计合成两套套式RT-PCR引物分型检测BVDV核酸。经试验表明,两套引物均能够对BVDV分型检测。综合比较引物的优势后,选取了NS5B区的引物建立套式RT-PCR检测方法。参考已发表文献,使用外源基因EGFP作为内部参照,设计合成了一系列引物获得大小不等的EGFP片段,比较试验选取了适合于本实验的片段引入反应体系中,并优化反应条件,以达到监控RT-PCR和PCR整个反应过程,结合阴性对照,使得检测结果准确真实。本实验结果表明,该方法相比商品化试剂盒在血清样品检测上更灵敏,最低可检测出10-4TCID50的病毒核酸,核酸最低检出量为2.6pg,且相比国内已报道的RT-PCR检测方法更为敏感。特异性试验表明本方法可以将BVDV与同属的猪瘟病毒及其他临床症状相似的牛病病原体区分开。应用本方法对东北地区四个不同奶牛养殖场共322份血清和132份奶液样品进检测,部分样品与商品化抗原捕获ELISA试剂盒的检测结果进行比较,符合率较低。后将阳性样品接种长满单层的MDBK细胞,盲传两代后再使用RT-PCR复检并测序,结果符合率100%。表明所建立的套式RT-PCR方法可以用于BVDV临床检测和流行病学监测。诊断结果结果显示所检牛场存在着BVDV感染。综上,本研究提供了一套切实可行、简便快捷且成本相对较低的牛病毒性腹泻病毒检测方法,为日后开展牛病毒性腹泻病毒的防控及牛源生物制品安全检测提供可靠技术手段。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 BVDV 生物学特征
• 1.1.1 BVDV 的形态特征
• 1.1.2 BVDV 的生物多样性
• 1.2 BVD/MD 的流行病学及危害
• 1.2.1 流行病学
• 1.2.2 BVDV 对生物制品的污染
• 1.2.3 BVDV 感染其它反刍动物
• 1.3 BVD/MD 在我国的防治状况
• 1.4 BVD/MD 的类型
• 1.4.1 急性感染
• 1.4.2 先天性感染
• 1.4.3 持续性感染 （PI）
• 1.4.4 黏膜病
• 1.4.5 繁殖障碍
• 1.4.6 免疫抑制
• 1.4.7 血小板减少症
• 1.5 BVDV 诊断技术研究进展
• 1.5.1 BVDV 血清学检测方法进展
• 1.5.2 BVDV 病原学检测方法进展
• 1.6 研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 生物学试剂
• 2.1.3 扩增引物
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞复苏
• 50测定'>2.2.2 BVDV 增殖和 TCID₅₀测定
• 2.2.3 样品处理和模板制备
• 2.2.4 PCR 引物的筛选
• 2.2.5 方法建立和反应条件优化
• 2.2.6 内参的选择和制备
• 2.2.7 敏感性试验
• 2.2.8 特异性试验
• 2.2.9 重复性试验
• 2.2.10 临床样品检测
• 2.2.11 接种 MDBK 细胞试验
• 3. 结果与分析
• 3.1 BVDV 目的基因 RT-PCR 扩增
• 3.2 BVDV 套式 RT-PCR 分型检测方法的建立和优化
• 3.2.1 退火温度优化
• 3.2.2 核酸最低检出量
• 3.2.3 引物浓度优化
• 3.2.4 rTaq 酶用量优化
• 2+用量优化'>3.2.5 Mg²⁺用量优化
• 3.2.6 循环参数优化
• 3.2.7 内参的制备
• 3.2.8 方法完成检验
• 3.2.9 敏感性试验
• 3.2.10 特异性试验
• 3.3 东北不同地区奶牛厂临床采样检测
• 3.4 接种 MDBK 细胞试验
• 4. 讨论
• 4.1 引物的设计
• 4.2 RT-PCR 反应条件的优化
• 4.3 RT-PCR 反应的特异性及敏感性
• 4.4 RT-PCR 在病料的检测应用
• 4.5 内部参照的作用
• 4.6 BVDV 分型检测的意义
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文