限制修饰缺失大肠杆菌的构建及其在微生物次级代谢研究中的应用

论文摘要

放线菌是重要的抗生素产生菌。抗生素等次级代谢的研究需要借助大肠杆菌菌株进行基因克隆,并通过特殊菌株介导属间接合转移以便开展基因中断或基因簇异源表达等研究。目前没有同时兼备上述功能的大肠杆菌菌株。本研究在广泛使用的大肠杆菌克隆宿主DH10B的基础上,依次敲除了甲基化基因dcm和dam,得到DNA甲基化缺陷的非限制型大肠杆菌JTU006 （Dcm-）和JTU007 （Dam-Dcm-）;探索了这些菌株在大质粒转化、接合转移和基因组文库构建及克隆次级代谢功能基因等研究中的应用。将带有39 kb放线紫红素生物合成基因簇的质粒接合转移到变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、阿维链霉菌、棒状链霉菌和红色糖多孢菌中,比较上述3种大肠杆菌菌株和ET12567介导接合转移的效率。结果发现不同的放线菌对甲基化差异的不同供体菌具有不同的优先次序:（1）变铅青链霉菌和阿维链霉菌以同等效率接受4种供体的接合转移;（2）天蓝色链霉菌优先接受Dam-Dcm-供体菌的接合转移,其次是Dam+Dcm-菌株,Dam+Dcm+供体效率最低;（3）对于棒状链霉菌和红色糖多孢菌,Dam+Dcm-菌株的接合转移效率比Dam-Dcm-供体菌分别高出100倍和10倍,也略高于Dam+Dcm+供体菌。这五种放线菌菌株都能异源表达放线紫红素。最后在JTU007中构建了毒三素链霉菌粘粒文库,并用高通量接合转移的方法把粘粒文库转入限制甲基化DNA的天蓝色链霉菌中,显示出新菌株兼备克隆和接合转移的能力。其中一个接合转移子能够产生棕色色素,经测序比对发现对应的cosmid克隆上带有合成黑色素相关的melC操纵子。JTU007比ET12567具有更高的转化效率和噬菌体转染的能力。JTU006文库转染的效率介于JTU007和DH10B之间,也能向天蓝色链霉菌接合转移,但效率不如JTU007。非限制型的大肠杆菌JTU006和JTU007比ET12567更适合用于DNA克隆,并且可以用来探索链霉菌和其它潜在异源表达宿主的限制系统。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 微生物合成基因簇的克隆与异源表达
• 1.1.1 初级代谢与次级代谢
• 1.1.2 微生物次级代谢产物基因成簇排列
• 1.1.3 微生物基因组文库构建方法
• 1.1.4 基于基因组文库的次级代谢产物克隆方法
• 1.1.5 异源表达理想的宿主
• 1.2 微生物限制修饰系统与DNA水平转移
• 1.2.1 宿主的限制修饰系统作用
• 1.2.2 大肠杆菌中的甲基化系统
• 1.2.3 链霉菌中已发现的限制系统
• 1.2.4 原生质体转化和接合转移
• 1.2.5 供体大肠杆菌
• 1.3 本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基与化学试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株培养及菌种保藏
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.2.4 大肠杆菌和放线菌总DNA的少量快速提取
• 2.2.5 聚合酶链式反应PCR及TA克隆
• 2.2.6 DNA片段的回收
• 2.2.7 DNA的酶切反应
• 2.2.8 DNA的去磷酸化处理
• 2.2.9 DNA的连接反应
• 2感受态的制备及转化'>2.2.10 大肠杆菌CaCl₂感受态的制备及转化
• 2.2.11 大肠杆菌电转化感受态的制备及电转化
• 2.2.12 大肠杆菌生长曲线的测定
• 2.2.13 大肠杆菌向链霉菌和红色糖多孢菌的接合转移
• 2.2.14 放线紫红素的表达及测定
• 2.2.15 Cosmid文库构建
• 2.2.16 Cosmid文库高通量接合转移
• 第三章 不同DNA甲基化供体菌构建及性状
• 3.1 前言
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 dcm甲基化基因的敲除
• 3.2.2 dam甲基化基因的敲除
• 3.2.3 各大肠杆菌供体甲基化状态
• 3.2.4 不同甲基化大肠杆菌的生长速率
• 3.2.5 不同甲基化大肠杆菌的转化效率
• 3.3 本章小结
• 第四章 限制修饰缺失菌株在异源表达研究中的应用
• 4.1 前言
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 对小质粒的限制作用
• 4.2.2 对大质粒的限制作用
• 4.2.3 变铅青链霉菌的接合转移和放线紫红素表达
• 4.2.4 天蓝色链霉菌的接合转移和放线紫红素表达
• 4.2.5 阿维链霉菌的接合转移和放线紫红素表达
• 4.2.6 棒状链霉菌的接合转移和放线紫红素表达
• 4.2.7 红色糖多孢菌的接合转移和放线紫红素表达
• 4.3 本章小结
• 第五章 限制修饰缺失菌株在克隆微生物基因簇中的应用
• 5.1 前言
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 在大肠杆菌JTU007中构建cosmid基因文库
• 5.2.2 高通量接合转移基因文库
• 5.2.3 高通量异源表达筛选微生物合成基因簇
• 5.3 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成的论文